M Ở ĐẦU
2.3.2 Phân lập cách ợp chất
Các mẫu tươi của Anthenea aspera (10 kg) đã được cắt thành miếng nhỏ và ngâm chiết ba lần với ethanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 40ºC. Dịch tổng thu được được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50ºC thu được 213 g cặn chiết tổng EtOH. Cặn chiết này được chiết phân đoạn lần lượt với n-hexane (1L x 3), EtOAc (1Lx3) và methanol (1Lx3) thu được các cặn chiết tương ứng: 45 g cặn n-hexane kí hiệu: SDH, 68 g cặn etyl axetat kí hiệu: SDE và 96g cặn metanol kí hiệu: SDM. Cặn SDH được tách trên cột silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexane/CH2Cl2 và CH2Cl2/MeOH (100-0% -> 0-100% v:v) thu được 9 phân đoạn kí hiệu SDH1- SDH9 tách trên cột silica gel với dung môi rửa giải n- hexane/CH2Cl2 và CH2Cl2/MeOH thu được 2 hợp chất: SD5 (0,53g), SD6 (1,02 g).
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập Anthenea aspera 2.4. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được SD5: 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), (ppm): 4,03 (1H, br, H-3); 1,96 (1H, dt, H- 12); 1,86 (2H, m, H-16); 1,67 (1H, m, H-7); 1,69/1,62 (2H, m, H-2); 1,52 (1H, m, H-5); 1,45 (1H, m, H-1); 1,51 (1H, m, H-25); 1,09 (1H, m, H-17); 0,65 (3H, s, H- 18); 0,78 (3H, s, H-19); 0,90 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-21); 0,86 (3H, d, J = 6,0 Hz, H- 26); 0,87 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-27). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), (ppm): 32,2 (t, C-1); 29,1 (t, C-2); 66,6 (d, C- 3); 35,9 (t, C-4); 39,2 (d, C-5); 28,6 (t, C-6); 32,0 (t, C-7); 35,5 (d, C-8); 54,4 (d, C-9); 36,1 (s, C-10); 20,8 (t, C-11); 40,0 (t, C-12); 42,6 (s, C-13); 56,6 (d, C-14); 24,2 (t, C-15); 28,3 (t, C-16); 56,3 (d, C-17); 12,1 (q, C-18); 11,2 (q, C-19); 35,8 (d, C-20); 18,7 (q, C-21); 36,2 (t, C-22); 23,8 (t, C-23); 39,5 (t, C-24) ; 28,0 (d, C-
25); 22,8 (q, C-26) ; 22,6 (q, C-27). SD6: 1H-NMR (500 MHz, CDCl3), (ppm): 5,15 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7); 3,60 (1H, br, H-3); 1,23 (2H, m, H-12); 1,35 (2H, m, H-16); 1,39 (1H, m, H-5); 1,25 (1H, m, H-17); 0,53 (3H, s, H-18); 0,79 (3H, s, H-19); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H- 21); 0,86 (3H, d, J = 9,0 Hz, H-26); 0,85 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-27). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3), (ppm): 37,1 (t, C-1); 31,5 (t, C-2); 71,5 (d, C- 3); 38,0 (t, C-4); 40,3 (d, C-5); 29,7 (t, C-6); 117,8 (d, C-7); 140,0 (s, C-8); 49,5 (d, C-9); 34,2 (s, C-10); 21,6 (t, C-11); 39,6 (t, C-12); 43,4 (s, C-13); 55,0 (d, C- 14); 22,9 (t, C-15); 27,9 (t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 13,0 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,6 (q, C-21); 36,1 (t, C-22); 23,9 (t, C-23); 39,5 (t, C-24) ; 28,1 (d, C-25); 22,6 (q, C-26) ; 22,8 (q, C-27).
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất SD5
SD5: Trong các phổ1H-NMR và 13C-NMR kết hợp với phổDEPT đã cho biết trong phân tử của chất SD5 có 27 nguyên tử carbon trong đó có 05 nhóm CH3, 12 nhóm methylen (CH2), 8 nhóm methylene (CH) và 2 nguyên tử carbon bậc 4. Phổ khối lượng ESI-MS cho [M]+ 388 amu. Các dữ liệu phổ13C-NMR và ESI-MS [20] cho phép xác định công thức phân tử chất này là C27H48O. Đây là một hợp chất thuộc khung cholestane.
Trên phổ1H-NMR quan sát được cho tín hiệu của proton thuộc carbon methyl có liên kết với nhóm hydroxyl (OH) tại H 4,03 (H-3), cùng với proton methyl tại H 0,99 (1H, H-14) và 1,09 (1H, H-15). Ngoài ra trên phổ của hợp chất này cũng quan sát được tín hiệu của cacproton thuộc 5 nhóm methyl, trong đó có 2 tín hiệu ở dạng singlet tại H 0,65 (H-18); 0,78 (H-19) và tín hiệu của 3 nhóm methyl còn lại đều ở dạng doublet tại H 0,90 (3H, d, H-21), 0,86 (3H, d, H-26); và 0,87 (3H, d, H-27).
Trên phổ 13C-NMR và DEPT cho biết ở vùng trường thấp có tín hiệu cộng hưởng carbon methyl C 66,6 ppm (C-3) tương ứng với proton tại H 4,03 ppm (H- 3). Hơn nữa cũng thấy rõ đặc trưng của 5 carbon methyl tại C 12,1 (q, C-18); 11,2 (q, C-19); 22,8 (q, C-26) ; 22,6 (q, C-27) tương ứng với phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu của 5 nhóm methyl.
Hình 3.2. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất SD5
Phân tích phổ HSQC và HMBC của SD5 chỉ ra một sốtương tác đặc trưng: H-18 tương tác với carbon tại ví trí C-12, C-13 và C-14, H-19 có tương tác với C- 1, C-10, và C-9, H-1 tương tác với C-2, C-19, và C-10.
Hình 3.3. Phổ HSQC của hợp chất SD5
Kết hợp các dữ liệu phổ thu được với tài liệu tham khảo đã cho phép khẳng định cấu trúc của chất SD5 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hoá học của 5α- cholestane-3α-ol. Bảng 3.1: Dữ liệu phổ của hợp chất SD5 CC δc ppm SBI-5 δc ppm (TLTK) δH (SBI-5) (J, Hz) C δc ppm (SBI-5) δc ppm (TLTK) δH (SBI-5) (J, Hz) 1 1 32,2 (t) 32,2 (t) 1.45 (m)/1.29 (m) 15 24,2 (t) 24,2 (t) 1.01 * 22 29,1 (t) 29,1 (t) 1.62 (m)/1.69 (m) 16 28,3 (t) 28,2 (t) 1,86 (2H,m) 33 66,6 (d) 66,5 (d) 4,03 (1H, br, s) 17 56,3 (d) 56,3 (d) 1,09 (1H) 44 35,9 (t) 35,9 (t) 1,49* 18 12,1 (q) 12,1 (q) 0,65 (3H, s) 55 39,2 (d) 39,1 (d) 1,52 (1H, m) 19 11,2 (q) 11,2 (q) 0,78 (3H, s) 66 28,6 (t) 28,6 (t) 1,21* 20 35,8 (d) 35,8 (d) 1.50* 77 32,0 (t) 32,0 (t) 1.67 (m)/1.48 (m) 21 18,7 (q) 18,7 (q) 0,90(3H,d,6.4Hz) 88 35,5 (d) 35,5 (d) 1,35* 22 36,2 (t) 36,2 (t) 1.39 (m)/0.98 (m) 99 54,4 (d) 54,3 (d) 0,74* 23 23,8 (t) 23,9 (t) 1.16 (m) /1.33 (m) 110 36,1 (s) 36,1 (s) - 24 39,5(t) 39,5 (t) 1,13 (2H) 111 20,8 (t) 20,8 (t) 1.55* 25 28,0 (d) 28,0 (d) 1,51 (1H,m) 112 40,1 (t) 40,1 (t) 1.96 (dt) 26 22,8 (q) 22,8 (q) 0,86 (3H,d, 6Hz) 113 42,6 (s) 42,6 (s) - 27 22,6 (q) 22,5 (q) 0,87 (3H,d,6Hz) 114 56,6 (d) 56,5 (d) 0,99 (1H, m)
3.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất SD6
SD6: Phổ1H-NMR của SD6 cũng tương tựnhư hợp chất SD5, quan sát thấy đặc trưng của proton thuộc carbon methyl liên kết với nhóm hydroxyl (OH) tại H 3,60 (1H, br, s, H-3). Ngoài ra cũng quan sát được tín hiệu của 5 nhóm methyl, trong đó có tín hiệu của 2 nhóm methyl ở dạng singlet tại H 0,53 (3H, s, H-18) và 0,79 (3H, s, H-19), tín hiệu proton của 3 nhóm methyl còn lại cũng như SD5 ở dạng doublet H 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,86 (3H, d, J = 9,0 Hz, H-26), và 0,85 (3H, d, J = 9,0 Hz, H-27). Tuy nhiên có điều khác biệt là trên phổ hợp chất
SD6 xuất hiện tín hiệu của 1 proton olephin tại H 5,15 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7).
Hình 3.5 Phổ1H-NMR của hợp chất SD6
Phổ 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT của SD6 cho biết có tổng số 27 carbon, trong đó có 3 carbon bậc 4 (C), 8 nhóm carbon methyl (CH), 11 nhóm carbon methylen (CH2) và 5 carbon methyl (CH3). Như vậy khác với SD6, hợp chất SD6 mất đi 1 nhóm CH2, thay vào đó là có thêm một nhóm methyl và 1 carbon bậc 4, như vậy trong phân tử có thêm một nối đôi tại C 117,8 ppm (d) và 140,0 (s), điều này cũng phù hợp với phổ 1H-NMR xuất hiện thêm tín hiệu của
proton tương ứng tại H 5,15 ppm. Và tín hiệu của 5 nhóm methyl tại C 11,9 (q, C-18), 13,0 (q, C-19), 18,6 (q, C-21), 0,86 (q, C-26), 0,85 (q, C-27) với các proton tương ứng lần lượt tại H0,53; 0,79; 0,92; 0,86; 0,85 ppm. Điều này cho thấy SD6 phù hợp với đặc trưng của khung cholestane.
Hình 3.6. Phổ13C-NMR và DEPT của hợp chất SD6
Phân tích phổ HSQC và HMBC xác định được vị trí nối đôi ở C-7 và C-8. Trên phổHMBC cũng quan sát được tương tác xa giữa H-7 với C-6, C-5, và C-9; giữa H-18 với C-12, C-13, C-14, C-17.
Kết hợp phân tích các dữ liệu phổ thu được so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định SD6 phù hợp với cấu trúc của hợp chất 5-cholest-7-en-3-ol.
Bảng 3.2:Dữ liệu phổ của hợp chất SD6 C δc ppm (SBI-7) δc ppm [TLTK] δH (SBI-7) (J, Hz) C δc ppm (SBI-7) δc ppm [TLTK] δH (SBI-7) (J, Hz) 1 37,1 (t) 37,1 (t) 1,83 (m) 15 22,9 (t) 22,9 (t) 1,52 (2H,m) 2 31,5 (t) 31,3 (t) 1,39(m) / 1.81 (m) 16 27,9 (t) 27,9 (t) 1,35 (2H,m) 3 71,5 (d) 71,7 (d) 3,60 (1H,br, s) 17 56,1 (d) 56,1 (d) 1,25 (1H) 4 38,0 (t) 37,8 (t) 1,71 (m)/1.28 (m) 18 11,9 (q) 11,8 (q) 0,535 (3H,s) 5 40,3 (d) 40,2 (d) 1,39 (1H, m) 19 13,0 (q) 12,9 (q) 0,79 (3H,s) 6 29,7 (t) 29,6 (t) 1,76 ( m)/1.77(m) 20 36,2 (d) 36,1 (d) 1,37 (1H) 7 117,8 (d) 117,2 (d) 5,15 (1H, d, 2Hz) 21 18,6 (q) 18,8 (q) 0,92 (3H,d, 6.5Hz) 8 140,0 (s) 139,3 (s) - 22 36,1 (t) 36,1 (t) 1,00 (2H, m) 9 49,5 (d) 49,4 (d) 1,63 (1H) 23 23,9 (t) 23,9 (t) 1.35 (2H) 10 34,2 (s) 34,1 (s) - 24 39,5 (t) 39,4 (t) 2,02(m)/1.13 (m) 11 21,6 (t) 21,5 (t) 1,55 (2H,m) 25 28,1 (d) 27,9 (d) 1,26(1H, m)/1.52 12 39,6 (t) 39,5 (t) 1,23 (2H) 26 22,6 (q) 22,5 (q) 0,86 (3H,d, 9.0Hz) 13 43,4 (s) 43,2 (s) - 27 22,8 (q) 22,7 (q) 0,85 (3H,d, 9.0Hz) 14 55,0 (d) 54,9 (d) 1,81 (1h)
KẾT LUẬN
1. Đã phân lập được 2 hợp chất khung cholestane từ loài sao biển Anthenea aspera. Các hợp chất 5α-cholestane-3α-ol, 5-cholest-7-en-3-ol, được phân lập bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
2. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR), hai chiều (COSY, HSQC, HMBC).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] http://www.vasi.gov.vn/757/da-xac-dinh-danh-muc-gan-12-000-loai-sinh-vat- bien-viet-nam/t708/c249/i907.
[2] L. H. Hyman, The Invertebrates, Vol. 4: Echinodermats, McGraw-Hill,(1955). [3] Antokhina T. I., O. V. Savinkhin, T. A. Britayev, Asteroidea of Vietnam with
some notes on their symbionts”, (2012).
[4] Đào Tấn Hỗ và c.s, Đa dạng sinh học của động vật Da gai ở Nha Trang và sự
suy giảm nguồn lợi của các loài kinh tế. Hội thảo Quốc gia về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ nhất, NXB Nông nghiệp, Hà nội, (2005), 568-572. [5] Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Hoài Nam,
P.V.Cường, Dược liệu biển Việt nam thực trạng và cơ hội phát triển, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, Hà nội (2012), 59-60.
[6] Blunt J.W et al., Copp B.R.., Munro M.H.G., Northcode P.T., Prinsep M. R,
Marine natural products, Nat. Prod. Rep, 23 (2006) 26-78.
[7] Chong Jiang, kennet G.Boyd, Andrew Mearns spragg- Two Diketopiperazines and One Halogenated Phenol from Cultures of the Marine Bacterium Pseudoalteromonas luteoviolacea, Natural Product Letters, (2000), 14 (6) 435-440.
[8] Phan Tống Sơn, Phan Minh Giang, Hóa học các hợp chất thiên nhiên tập 1, NXB Văn hóa dân tộc, (2016)
[9]. Riccio, Rs. et al., Tet. Lett., (1982), 23, 2899.
[10]. Findlay, J.A. et al., J. Nat. Prod., (1983), 46, 876-880. [11]. Honda, M. et al., Tet. Lett., (1986), 27, 3369-3372. [12]. Pizza, C et al., Gazz. Chim. Ital., (1985), 115, 585. [13]. Casapullo, A. et al., J. Nat. Prod., (1993), 56, 105-115.
[14]. F. De Riccardis, L. Minale, E. Palagiano, R. Ricco, Two novelpolyhydroxysteroids with a 24-Ethyl hydroxy suloxy side chain from the deep water starfish Styracaster caroli, Joural of Natural Products, (1996), 59, 368-390.
[15]. M. Iorizzi, F. De Riccardis, I. Izzo, E. Palagiano, L. Minale, R. Ricco, C. Debitus, D. Duhet, Polyoxygenated marine steroids from the deep water starfish Styracaster caroli, Joural of Natural Products, (1994), 57, 1361-1373. [16]. F. De Riccardis, I. Izzo, M. Iorizzi, E. Palagiano, L. Minale, R. Ricco, Two
novelpolyhydroxysteroids with a 24-Ethyl hydroxy suloxy side chain from the deep water starfish Styracaster caroli, Joural of Natural Products, (1996), 59, 386-390.
[17] M. Iorizzi, G. Bifulco, F. Riccardis, l. Minale, R. Ricco, F. Zollo, A reinvestigation of the polar steroids from the starfish Oreaster reticulatus: isolation of sixteen steroidal oligoglycosides and six polyhydroxysteroids, (1995).
[18] Trịnh Thị Thu Hương, Nghiên cứu thành phần hóa học của loài sao biển Anthenea pentagonula, Luận văn thạc sỹ, (2007).
[19] Châu Văn Minh, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Văn Thanh, Hoàng Thanh Hương, Phan Văn Kiệm, Highly oxygenated sterols from the starfish Archaster typicus, Journal of Chemistry, (2007), 377-381.
[20] Nguyễn Văn Thanhvà c.s, Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt
tính gây độc tế bào in vitro của loài Hải sâm Holothuria scabra và loài sao biển Archacter typicus sinh sống tại vùng biển Việt Nam, (2008).
[21] Higuchi, R. et al., Annalen, (1988), 1185-1189.
[22] M. Honda, T. Igarashi, N. Marubayashi, T. Komori, Biologicallly active glycosides from asteroidea, (1991), 595-598.
[23] [24] Y. Peng, J. Zheng, R. Huang, Y. Wang , T. Xu, X. Zhou, Q. Liu, F. Zeng, H. Ju, X. yang, Y. Liu, Polyhydroxy steroids and saponins from China sea starfish Asterina pectinifera and their biological activities, Chemical & pharmaceutical bulletin, (2010), 58, 856-858.
[25] Kicha AA, Ivanchina NV, Kalinovsky AI, Dmitrenok PS, Smirnov AV. Two new steroid glycosides from the Far East starfish Hippasteria kurilensis. Rus J. Bioorg Chem , (2009), 35.
[26] Ngoan BT,Hanh TT, Vien le, Diep CN, Thao NP, Thao do T, Thanh NV, Cuong NX, Nam NH, Thung do, Kiem PV, Kim YH, Minh CV,
Asterosaponins and glycosylated polyhydroxysteroids from the starfish Culcita novaeguineae and their cytotoxic activities, (2015).
[27] Ahmed A.Zaki, ZulfiqarAli, Yan-HongWang, Yasser A.El-Amier, Shabana I.Khan, Ikhlas A.Kha, Cytotoxic steroidal saponins from Panicum turgidum Forssk, (2017), 14-19.
[28] Natalia V. Ivanchina, Alla A. Kicha, Timofey V. Malyarenko, Sofya D. Ermolaeva,Ekaterina A. Yurchenko, Evgeny A. Pislyagin, Chau Van Minh