4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực ti ễn
2.2.5. Phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen mã hóa trong điều
kiện thường và điều kiện mặn
Sự biểu hiện của các gene ở điều kiện thƣờng đƣợc phân tích thông qua kết quả RNA-seq (giải trình tự tổng hợp ARN thông tin) của cây đậu tƣơng trong nghiên cứu của Libault[42].
Nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng dữ liệu từ cơ sở dữ liệu CEO của NCBI với số hiệu GSE57252 [11] để phân tích sự biểu hiện của các gene mã hóa thuộc các họ TF bHLH, bZIP, SRF trong điều kiện mặn qua kết quả RNA-seq. Những hạt giống của G. max cv.Williams 82 đã nảy mầm trên giấy ẩm và chờ chúng phát triển đến giai đoạn v1 (giai đoạn có 3 lá kép đầu tiên trong buồng sinh trƣởng duy trì ở 770F (250C) và độ ẩm 60% trong suốtthí nghiệm. Nhiệt độ và độ ẩm liên tục đƣợc theo d i và duy trì trong
buồng tăng trƣởng. Việc xử lý muối đƣợc áp dụng b ng cách chuyển cây con
vào dung dịch NaCl 100 mM.Mô rễ s đƣợc thu sau 0, 1, 6 và 12 giờ điều trị căng thẳng. Sử dụng 5 cây cho mỗi lần tại một thời điểm điều trị căng thẳng. Sau khi thu mẫu mô rễ từ cây trong điều kiện mặn s tiến hành tinh sạch RNA và giải trình tự, xử lí số dữ liệu và phân tích biển hiện của gene [11].
18
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích đặc tính protein của ba nhóm TF giàu Met ở đậu tƣơng
3.1.1. Nhóm bHLH ở đậu tương
Trình tự protein và mã định danh của 21 TF giàu Met, bao gồm 11 TF nh m bHLH, 3 TF nh m bZIP và 7 TF nh m SRF đƣợc khai thác từ nghiên cứu trƣớc đây của Chu Đức Hà [21]. Một số đặc tính cơ bản của các họ TF trong nghiên cứu đƣợc khai thác và tìm kiếm b ng cách tiến hành truy vấn trình tự protein b ng các công cụ tin sinh học.Đặc tính của phân tử protein, bao gồm kích thƣớc phân tử, trọng lƣợng phân tử, điểm đẳng điện, chỉ số bất ổn định, chỉ số béo và độ ƣa nƣớc trung bình đƣợc xác định thông qua công cụ Expasy [17]. Công cụ Expasy là cơ sở dữ liệu về hệ thống nghiên cứu phân tích cấu trúc phiên mã [17]. Chính vì vậy, đây là cơ sở dữ liệu đƣợc hầu hết nhà khoa học trên thế giới sử dụng để thu thập và khai thác các thông tin cơ bản của phân tử protein, trong đ c kích thƣớc phân tử, trọng lƣợng phân tử, điểm đẳng điện, chỉ số bất ổn định, chỉ số béo và độ ƣa nƣớc trung bình của phân tử protein. Ngoài ra chúng tôi sử dụng công cụTargetP đểxác định vị trí của các phân tử protein trong tế bào.
Từ kết quảthu đƣợc ở bảng 3.1 có thể thấy, kích thƣớc và trọng lƣợng của các protein thuộc họ TF bHLH rất đa dạng, dao động trong khoảng từ 259 đến 491 amino acid. Trung bình kích thƣớc của các protin thuộc họTF bHLH đạt khoảng 380 amino acid. Chuỗi protein ngắn nhất là Glyma06g04380 đạt 258 amino acid, trong khi đ chuỗi dài nhất là Glyma10g04890 đƣợc cấu tạo từ 481 amino acid. Trọng lƣợng của protein tỷ lệ thuận với kích thƣớc, dao động trong khoảng từ 29,2 (Glyma02g00980 đến 54,3 kDa (Glyma10g04890). Khối lƣợng trung bình khoảng 42,4kDa. Với kích thƣớc và trọng lƣợng phân tử khá cao dẫn đến các protein họbHLH c độ linh hoạt thấp.
19
Mặt khác, giá trịđiểm đẳng điện của các phân tử protein cũng đƣợc chứng minh là có liên quan tới vị trí và chức năng của các protein trong tế bào [24]. Phân tích ba vị trí dƣới tế bào của các protein đ trong thấy r ng trong plasmtid và proteome ty thể của thực vật c dƣ thừa một lƣợng protein có tính acid. Tế bào chất và các proteome màng gồm có cả protein có tính acid và protein basic, proteome nhân có tỷ lệ tƣơng đối của các protein có tính acid và protein basic. Các protein có tính acid mạnh nhất không chỉ có ở tế bào chất mà còn có trong các không bào, lysosome và nhiều protein acid tạo thành khung tế bào [24]. Nhìn chung các protein c tính acid thƣờng đƣợc phân bố ở tế bào chất, trong ty thể và một số bào quan c màng thƣờng chứa protein c tính base. Kết quả cho thấy, các phân tử protein thuộc họ TF bHLH có giá trị pI trong khoảng từ 5,84 (Glyma10g04890 đến 9,26 (Glyma02g00980). Các protein n m trong khoảng từ 5,84 đến 6,84 bao gồm glyma10g04890,
glyma20g22280, glyma13g19250, glyma06g04380, glyma04g04190 là những
protein có tính acid. Chúng s đƣợc vận chuyển ra tế bào chất ngay sau khi đƣợc tổng hợp trong nhân. Có 6 protein còn lại n m trong khoảng pI từ 7,2 đến 9,26 là những protein có tính base gồm glyma03g32740, glyma11g17120, glyma01g15930, glyma05g19920, glyma03g04000, glyma02g00980. Chúng có thể đƣợc bám trên ty thể hoặc các hệ thống có màng khác.
20
Bảng 3.1: Đặc tính của nhóm protein họ bHLH ở đậu tƣơng
Ghi chú: L(aa): Kích thước (amino acid), mW: Trọng lượng phân tử, C: Lục lạp, M: Ty thể, S: hệ thống bao gói, *: Độ
tin cậy cao.
STT Tên Protein %Met L(aa) mW (kDa) pI II Chỉ số béo GRAVY Vị trí
1 Glyma01g15930 6,75 458 49,2 8,88 47,61 55,15 -0,549 C 2 Glyma02g00980 6,15 259 29,2 9,26 39,46 88,49 -0,098 S 3 Glyma03g04000 7,54 397 44,2 9,14 51,91 55,21 -0,695 _ 4 Glyma03g32740 6,22 481 52,6 7,2 63,57 60,29 -0,511 M 5 Glyma04g04190 7,17 264 30,2 6,84 68,89 57,31 -0,781 _ 6 Glyma11g17120 7,73 465 49,9 8,63 46,28 51,63 -0,576 C 7 Glyma13g19250 6,29 476 52,6 6,03 65,52 49,1 -0,82 M 8 Glyma20g22280 6,79 426 44,8 5,92 62,84 51,6 -0,656 _ 9 Glyma05g19920 6,2 273 30,4 8,93 52,3 64,25 -0,531 _ 10 Glyma06g04380 7,34 258 29,4 6,63 59,36 59,07 -0,719 _ 11 Glyma10g04890 6,1 491 54,3 5,84 65,4 50,92 -0,845 _
21
Chỉ số bất ổn định (II cũng đƣợc đề cập tới và sử dụng để xác thời gian bán hủy của protein trong ống nghiệm. Theo kết quả phân tích, chỉ có duy nhất một phân tử protei có chỉ số II = 39,46 < 40 nên s có thời gian bán hủy dài hay nói cách khác thì chúng s ổn định trong ống nghiệm. Còn lại 10 phân tử protein có chỉ số II > 40 vậy nên s có thời gian bán hủy ngắn và kém ổn định trong ống nghiệm.
Khi quan sát bảng 3.1 ta có thể thấy r ng các chỉ số về độ ƣa nƣớc trung bình của các protein họ bHLH đều nhỏ hơn 0 (GRAVY < 0 chứng tỏ r ng chúng đều c tính ƣa nƣớc.
Ngoài ra, trong nghiên cứu này chúng tôi cũng sử dụng chỉ số béo Aliphatic để đánh giá các protein. Chỉ sốnày đƣợc coi là một yếu tố tích cực đểgia tăng khả năng chịu nhiệt của các protein hình cầu. Điều này c ý nghĩa thật sự với những phân tử có khối lƣợng dƣới 100.
Nh m tăng độ tin cậy cho kết quả, chúng tôi đã sử dụng phần mềm TagertP đểxác định vị trí của những phân tử protein này trong tế bào. Kết quả cho thấy có thể có 2 protein là Glyma01g15930 và Glyma11g17120 s n m tại lục lạp. Đối với ty thể có thể có sự xuất hiện của 2 protein là Glyma03g32740 và Glyma13g19250. Trong hệ thống bao gói của tế bào có thể có sự hiện diện của protein Glyma02g00980. Đây đƣợc xem là dẫn liệu quan trọng trong những nghiên cứu chức năng gene tiếp theo.
22
3.1.2.Nhóm bZIP ở đậu tương
Bảng 3.2: Đặc điểm protein nhóm bZIP ởcây đậu tƣơng
Tên Protein Nội dung
Glyma02g01600 Glyma08g12170 Glyma05g28960
%Met 6,67 7,69 7,32 L(aa) 149 168 163 mW (kDa) 16,9 19,1 18,4 pI 5,07 5,24 5,23 II 55,4 44,66 43,56 Chỉ số béo 68,19 65,71 68,34 GRAVY -0,664 -0,735 -0,645 Vị trí C* C* C*
Ghi chú: L(aa): Kích thước (amino acid), mW: Trọng lượng phân tử, C: Lục lạp, M: Ty thể, S: Hệ thống bao gói, *: Độ tin cậy cao.
Phân tích kết quả bảng 3.2, kích thƣớc và trọng lƣợng của các phân tử protein trong nhóm bZIP khá là nhỏ. Chiều dài phân tử dao động trong
khoảng 149 amino acid (Glyma02g01600 đến 169 amino acid
(Glyma08g12170). Khối lƣợng phân tử n m trong khoảng từ 16,9kDa (Glyma02g01600 đến 19,1kDa (Glyma08g12170). Nhìn chung các phân tử protein này c kích thƣớc và trọng lƣợng tƣơng đối nhỏlàm chúng c độ linh hoạt cao và có thể dễ dàng đƣợc xuất hoặc nhập qua màng sinh học để đƣợc thực hiện chức năng trong tế bào.
Tất cả ba phân tử protein gồm Glyma02g01600, Glyma08g12170, Glyma05g28960 đều có giá trị pI n m trong 5,07 đến 5,24 và mang tính acid rất cao. Cho nên những phân tử này s đƣợc vận chuyển ra tế bào chất ngay sau khi đƣợc tổng hợp trong nhân.
23
Ngoài chỉ số pI thì chúng tôi còn phân tích thêm chỉ số béo, II và GRAVY. Các chỉ số II của protein thuộc nh m bZIP đều lớn hơn 40 vậy nên tính ổn dịnh trong ống nghiệm của chúng không cao. Nhìn chung đây là các phân tử protein c tính ƣa nƣớc vì chỉ số GRAVY < 0. Chỉ số béo đƣợc coi là một yếu tố tích cực để gia tăng khả năng chịu nhiệt của các protein hình cầu. điều này c ý nghĩa thật sự với những phân tử có khối lƣợng dƣới 100.
Để tăng thêm độ tin cậy, chúng tôi đã sử dụng phần mềm Tagert P để xác định vị trí của những phân tử protein này trong tế bào. Kết quả cho thấy tất cả các protein trong nh m này đều có thể đƣợc phân bố ở lục lạp. Đây đƣợc xem là dẫn liệu quan trọng trong những nghiên cứu chức năng gene tiếp theo.
3.1.3. Nhóm SRF ở đậu tương
Tiến hành phân tích đặc tính của các protein thuộc nhóm TF SRF qua bảng 3.3, ta có thể thấy kích thƣớc và trọng lƣợng của nhóm này tƣơng đối là nhỏ. Kích thƣớc của chúng n m trong khoảng 156 amino acid
(Glyma11g30490 và Glyma11g30620) đến 247 amino acid
(Glyma10g40080). Bên cạnh đ , trọng lƣợng protein cũng nhỏ dao động từ 17,9kDa (Glyma11g30490 đến 27,8kDa (Glyma10g40080). Khối lƣợng phân tử trung bình chỉ vào khoảng 21kDa. Đối với những phân tử có trọng lƣợng và kích thƣớc nhỏ thì các protein thuộc TF SRF c độ linh hoạt rất cao và có thể dễ dàng xuất hoặc nhập qua màng tế bào để thực hiện chức năng sinh học của chúng.
Bên cạnh đ , chỉ số pI của TF SRF cũng đƣợc chúng tôi đề cập tới trong nghiên cứu này. Ở đây chỉ có duy nhất 1 protein có tính acid đ là Glyma11g26260 (pI = 6,84). Còn lại 6 protein đều mang tính base với pI dao động trong khoảng từ 9,26 (Glyma11g30490 đến 10 (Glyma18g05930). Rất có thể những protein mang tính base này s bám trên ty thể hoặc các hệ thống có màng khác của tế bào.
24
Khi tiến hành phân tích chỉ sốổn định của nhóm protein thuộc TF SRF kết quả cho thấy tất cả các protein của nh m này đề có chỉ số II > 40. Từ đây c thể nhận thấy r ng những protei này có thời gian bán hủy ngắn hay nói cách khác độổn định của chúng trong ống nghiệm không cao. Chỉ số GRAVY của nhóm này thể hiện đây là những phân tử protein đều c tính ƣa nƣớc (GRAVY < 0 . Đối với chỉ số béo Aliphatic c liên quan đến độ chịu nhiệt của protein hình cầu. Điều này c ý nghĩa thật sự với những phân tử có khối lƣợng dƣới 100.
Để tăng cƣờng độ tin cậy của phép dự đoán, định khu dƣới tế bào của họ TF SRF đƣợc phân tích b ng công cụ TargetP. Kết quả cho thấy là các protein này chƣa đƣợc xác định vị trí rõ ràng trong tế bào và có thể chúng s đƣợc phân bố tại các hệ thống bao gói trong tế bào. Đây đƣợc xem là dẫn liệu quan trọng trong những nghiên cứu chức năng gene tiếp theo.
25
Bảng 3.3: Đặc tính protein nhóm SRF ởcây đậu tƣơng
STT Tên protein %Met L(aa) mW (kDa) pI II Chỉ số béo GRAVY Vị trí 1 Glyma11g26260 6,79 161 18,7 6,84 55,54 84,04 -0,65 _ 2 Glyma11g30490 7,69 156 17,9 9,26 57,12 76,22 -0,437 _ 3 Glyma11g30620 7,69 156 18 9,37 55,52 80,58 -0,42 _ 4 Glyma18g05930 10,12 168 19,7 10 58,23 67,98 -0,641 _ 5 Glyma18g05960 7,55 159 18,2 9,13 59,28 71,13 -0,574 _ 6 Glyma20g27320 6,67 239 26,7 9,79 55,34 63,35 -0,444 _ 7 Glyma10g40080 6,45 247 27,8 9,76 46,27 67,49 -0,466 _
Ghi chú: L(aa): Kích thước (amino acid), mW: Trọng lượng phân tử, C: Lục lạp, M: Ty thể, S: Hệ thống bao gói,
26
3.2. Phân tích mật độ phân bố Met ở ngoài vùng bảo thủ của c c nhóm TF giàu Met ở đậu tƣơng
Sau khi tiến hành phân tách các trình tự amino acid ở ngoài vùng bảo thủ của các TF là bHLH, bZIP và SRF chúng tôi đã sử dụng phần mềm BioEdit để tính hàm lƣợng Met và thu đƣợc kết quảnhƣ hình 3.1.
Kết quả cho thấy, trong tổng số 11 protein thuộc TF bHLH có 8 protein có tỉ lệ Met tập trung ở ngoài vùng bảo thủ rất cao từ 10,14% (Glyma06g04380)
cho tới 21,05% (Glyma03g04000 . Đa phần các protein c tỉ lệ Met phân bố
ngoài v ng bảo thủ cao đều là các protein n m trong ty thể hoặc hệ thống bao g i của tế bào.Trong tổng số 3 protein thuộc họ TF bZip chỉ duy nhất protein Glyma02g01600 có tỉ lệ Met ở v ng thƣợng nguồn cao (10% . Protein này c thể đƣợc phân bố ở lục lạp. Họ TF SRF, tất cả các protein c tỉ lệ Met ngoài v ng bảo thủ cao đều là các protein c tính base. Chúng c thể đƣợc phân bố trong ty thể hoặc hệ thống bao g i trong tế bào. Nhƣ vậy sau khi phân tích chúng tôi đã tìm thấy 15 trong tổng số 21 gene c sự phân bố Met nhiều ở quanh v ng bảo thủ, vì thế các gốc Met này c thể giúp các protein đáp ứng lại với các điều kiện bất lợi từ ngoại cảnh.
27
28
3.3. Phân tích dữ liệu biểu hiện của c c gene mã hóa TF giàu Met ở đậu tƣơngtrong c c điều iện
Dựa trên nghiên cứu của Libault, chúng tôi tiến hành phân tích biểu hiện gene của các họ TF ở điều kiện thƣờng qua kết quả RNA-seq ở 9 mô khác nhau của cây đậu tƣơng gồm tế bào lông rễ (RH sau khi gieo 84 giờ và 120 giờ(HAS , mô ch p rễ (RT , mô rễ (R , nốt sần (N , mô lá (L , mô phân sinh
đỉnh (SAM , mô hoa (F)và vỏ quả xanh (GP). Chúng đƣợc phân thành 4 mức độ dựa vào biểu hiện đặc trƣng của từng mô: mức dƣới ngƣỡng phát hiện
(fold change < 3 , c biểu hiện (3 ≤ fold change ≤ 10 , c xu hƣớng biểu hiện (10 ≤ fold change ≤ 100 , biểu hiện mạnh (100 ≤ fold change < 1000) [32].
Từ các dữ liệu đã c chúng tôi xây dựng biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện của các mô nhƣ hình 3.2.
Hình 3.2: Sự biểu hiện của các gene bHLH, bZIP, SRF của cây đậu tƣơng trong các mô ở điều kiện thƣờng
29
Kết quả trên cho thấy các gene thuộc 2 họ TF là bHLH và bZIP đều c biểu hiện mạnh ở ít nhất là một mẫu mô. Trong họTF bHLH c 4 gene biểu hiện mạnh ở hoa và lá gồm Glyma01g15930, Glyma11g17120,
Glyma03g32740 và Glyma13g19250 c thể tham gia vào quá trình sinh
trƣởng và phát triển của cây. Đáng chú ý là gene Glyma03g32740 và
Glyma13g19250 đƣợc phân bố tại ty thể, c thể đáp ứng lại những bất lợi ở
hoa và lá.
Quan sát các gene thuộc TF bZIP c thể thấy tất cả các gene đều hiện ở hầu hết các mô, đặc biệt chúng biểu hiện mạnh nhất ở các bộ phận dƣới mặt đất. Gene Glyma02g01600 biểu hiện mạnh nhất tại 4 mô là nốt sần, hoa, rễ và lông rễ. Ngoài ra gene Glyma05g2896 cũng đặc biệt biểu hiện rất mạnh tại mô nốt sần. Hầu nhƣ các gene thuộc họ TF SRF đều biểu hiện ở dƣới ngƣỡng phát hiện ngoại trừ gene Glyma11g26260 c biểu hiện ở rễ.
Ngoài ra trong nghiên cứu này, yếu tố bất lợi đƣợc chúng tôi quan tâm đến là độ mặn cao. Đây đƣợc coi là một trong những yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây trồng. Các yếu tố mặn giúp tăng cƣờng sự điều chỉnh để đáp ứng các bất lợi của gene, ngƣợc lại điều kiện hạn s giảm sự điều chỉnh của gene [11]. Trong một nghiên cứu của Belamkar năm
2014 về dữ liệu đặc điểm toàn diện và định dạng RNA-seq của họ TF HD-ZIP
ở cây đậu tƣơng trong điều kiện hạn và mặn cao [11]. Dữ liệu đƣợc thu thập