4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực ti ễn
3.1.3. Nhóm SRF ở đậu tương
Tiến hành phân tích đặc tính của các protein thuộc nhóm TF SRF qua bảng 3.3, ta có thể thấy kích thƣớc và trọng lƣợng của nhóm này tƣơng đối là nhỏ. Kích thƣớc của chúng n m trong khoảng 156 amino acid
(Glyma11g30490 và Glyma11g30620) đến 247 amino acid
(Glyma10g40080). Bên cạnh đ , trọng lƣợng protein cũng nhỏ dao động từ 17,9kDa (Glyma11g30490 đến 27,8kDa (Glyma10g40080). Khối lƣợng phân tử trung bình chỉ vào khoảng 21kDa. Đối với những phân tử có trọng lƣợng và kích thƣớc nhỏ thì các protein thuộc TF SRF c độ linh hoạt rất cao và có thể dễ dàng xuất hoặc nhập qua màng tế bào để thực hiện chức năng sinh học của chúng.
Bên cạnh đ , chỉ số pI của TF SRF cũng đƣợc chúng tôi đề cập tới trong nghiên cứu này. Ở đây chỉ có duy nhất 1 protein có tính acid đ là Glyma11g26260 (pI = 6,84). Còn lại 6 protein đều mang tính base với pI dao động trong khoảng từ 9,26 (Glyma11g30490 đến 10 (Glyma18g05930). Rất có thể những protein mang tính base này s bám trên ty thể hoặc các hệ thống có màng khác của tế bào.
24
Khi tiến hành phân tích chỉ sốổn định của nhóm protein thuộc TF SRF kết quả cho thấy tất cả các protein của nh m này đề có chỉ số II > 40. Từ đây c thể nhận thấy r ng những protei này có thời gian bán hủy ngắn hay nói cách khác độổn định của chúng trong ống nghiệm không cao. Chỉ số GRAVY của nhóm này thể hiện đây là những phân tử protein đều c tính ƣa nƣớc (GRAVY < 0 . Đối với chỉ số béo Aliphatic c liên quan đến độ chịu nhiệt của protein hình cầu. Điều này c ý nghĩa thật sự với những phân tử có khối lƣợng dƣới 100.
Để tăng cƣờng độ tin cậy của phép dự đoán, định khu dƣới tế bào của họ TF SRF đƣợc phân tích b ng công cụ TargetP. Kết quả cho thấy là các protein này chƣa đƣợc xác định vị trí rõ ràng trong tế bào và có thể chúng s đƣợc phân bố tại các hệ thống bao gói trong tế bào. Đây đƣợc xem là dẫn liệu quan trọng trong những nghiên cứu chức năng gene tiếp theo.
25
Bảng 3.3: Đặc tính protein nhóm SRF ởcây đậu tƣơng
STT Tên protein %Met L(aa) mW (kDa) pI II Chỉ số béo GRAVY Vị trí 1 Glyma11g26260 6,79 161 18,7 6,84 55,54 84,04 -0,65 _ 2 Glyma11g30490 7,69 156 17,9 9,26 57,12 76,22 -0,437 _ 3 Glyma11g30620 7,69 156 18 9,37 55,52 80,58 -0,42 _ 4 Glyma18g05930 10,12 168 19,7 10 58,23 67,98 -0,641 _ 5 Glyma18g05960 7,55 159 18,2 9,13 59,28 71,13 -0,574 _ 6 Glyma20g27320 6,67 239 26,7 9,79 55,34 63,35 -0,444 _ 7 Glyma10g40080 6,45 247 27,8 9,76 46,27 67,49 -0,466 _
Ghi chú: L(aa): Kích thước (amino acid), mW: Trọng lượng phân tử, C: Lục lạp, M: Ty thể, S: Hệ thống bao gói,
26
3.2. Phân tích mật độ phân bố Met ở ngoài vùng bảo thủ của c c nhóm TF giàu Met ở đậu tƣơng
Sau khi tiến hành phân tách các trình tự amino acid ở ngoài vùng bảo thủ của các TF là bHLH, bZIP và SRF chúng tôi đã sử dụng phần mềm BioEdit để tính hàm lƣợng Met và thu đƣợc kết quảnhƣ hình 3.1.
Kết quả cho thấy, trong tổng số 11 protein thuộc TF bHLH có 8 protein có tỉ lệ Met tập trung ở ngoài vùng bảo thủ rất cao từ 10,14% (Glyma06g04380)
cho tới 21,05% (Glyma03g04000 . Đa phần các protein c tỉ lệ Met phân bố
ngoài v ng bảo thủ cao đều là các protein n m trong ty thể hoặc hệ thống bao g i của tế bào.Trong tổng số 3 protein thuộc họ TF bZip chỉ duy nhất protein Glyma02g01600 có tỉ lệ Met ở v ng thƣợng nguồn cao (10% . Protein này c thể đƣợc phân bố ở lục lạp. Họ TF SRF, tất cả các protein c tỉ lệ Met ngoài v ng bảo thủ cao đều là các protein c tính base. Chúng c thể đƣợc phân bố trong ty thể hoặc hệ thống bao g i trong tế bào. Nhƣ vậy sau khi phân tích chúng tôi đã tìm thấy 15 trong tổng số 21 gene c sự phân bố Met nhiều ở quanh v ng bảo thủ, vì thế các gốc Met này c thể giúp các protein đáp ứng lại với các điều kiện bất lợi từ ngoại cảnh.
27
28
3.3. Phân tích dữ liệu biểu hiện của c c gene mã hóa TF giàu Met ở đậu tƣơngtrong c c điều iện
Dựa trên nghiên cứu của Libault, chúng tôi tiến hành phân tích biểu hiện gene của các họ TF ở điều kiện thƣờng qua kết quả RNA-seq ở 9 mô khác nhau của cây đậu tƣơng gồm tế bào lông rễ (RH sau khi gieo 84 giờ và 120 giờ(HAS , mô ch p rễ (RT , mô rễ (R , nốt sần (N , mô lá (L , mô phân sinh
đỉnh (SAM , mô hoa (F)và vỏ quả xanh (GP). Chúng đƣợc phân thành 4 mức độ dựa vào biểu hiện đặc trƣng của từng mô: mức dƣới ngƣỡng phát hiện
(fold change < 3 , c biểu hiện (3 ≤ fold change ≤ 10 , c xu hƣớng biểu hiện (10 ≤ fold change ≤ 100 , biểu hiện mạnh (100 ≤ fold change < 1000) [32].
Từ các dữ liệu đã c chúng tôi xây dựng biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện của các mô nhƣ hình 3.2.
Hình 3.2: Sự biểu hiện của các gene bHLH, bZIP, SRF của cây đậu tƣơng trong các mô ở điều kiện thƣờng
29
Kết quả trên cho thấy các gene thuộc 2 họ TF là bHLH và bZIP đều c biểu hiện mạnh ở ít nhất là một mẫu mô. Trong họTF bHLH c 4 gene biểu hiện mạnh ở hoa và lá gồm Glyma01g15930, Glyma11g17120,
Glyma03g32740 và Glyma13g19250 c thể tham gia vào quá trình sinh
trƣởng và phát triển của cây. Đáng chú ý là gene Glyma03g32740 và
Glyma13g19250 đƣợc phân bố tại ty thể, c thể đáp ứng lại những bất lợi ở
hoa và lá.
Quan sát các gene thuộc TF bZIP c thể thấy tất cả các gene đều hiện ở hầu hết các mô, đặc biệt chúng biểu hiện mạnh nhất ở các bộ phận dƣới mặt đất. Gene Glyma02g01600 biểu hiện mạnh nhất tại 4 mô là nốt sần, hoa, rễ và lông rễ. Ngoài ra gene Glyma05g2896 cũng đặc biệt biểu hiện rất mạnh tại mô nốt sần. Hầu nhƣ các gene thuộc họ TF SRF đều biểu hiện ở dƣới ngƣỡng phát hiện ngoại trừ gene Glyma11g26260 c biểu hiện ở rễ.
Ngoài ra trong nghiên cứu này, yếu tố bất lợi đƣợc chúng tôi quan tâm đến là độ mặn cao. Đây đƣợc coi là một trong những yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây trồng. Các yếu tố mặn giúp tăng cƣờng sự điều chỉnh để đáp ứng các bất lợi của gene, ngƣợc lại điều kiện hạn s giảm sự điều chỉnh của gene [11]. Trong một nghiên cứu của Belamkar năm
2014 về dữ liệu đặc điểm toàn diện và định dạng RNA-seq của họ TF HD-ZIP
ở cây đậu tƣơng trong điều kiện hạn và mặn cao [11]. Dữ liệu đƣợc thu thập từ GEO đƣợc truy cập theo số hiệu GSE57252. Từ những dẫn liệu trên chúng
tôi đã thiết lập thành biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện của các gene mã hóa
30
Hình 3.3: Sự biểu hiện của các gene bHLH, bZIP, SRF của cây đậu tƣơng trong các mô ở điều kiện mặn
(Na0hrR: mẫu rễ sau 0 giờ trong dung dịch NaCl, Na1hrR: mẫu rễ sau 1 giờ
trong dung dịch NaCl, Na6hrR: mẫu rễ sau 6 giờ trong dung dịch NaCl,
Na12hrR: mẫu rễ sau 12 giờ trong dung dịch NaCl)
Kết quả thu đƣợc 10 gene trên tổng số 21 gene c biểu hiện khi xử lí trong điều kiện mặn cao. Họ TF bHLH c 6 gene biểu hiện gồm Glyma01g15930, Glyma03g04000, Glyma20g22280, Glyma03g32740, Glyma13g19250, Glyma10g04890. Trong điều kiện mặn 2 gene Glyma03g32740, Glyma13g19250 c biểu hiện mạnh, c thể đáp ứng các bất lợi cho cây. Các gene trong họ TF bZIP đều c biểu hiện rất mạnh trong điều kiện mặn. Gene
Glyma02g01600 c biểu hiện mạnh nhất ở cả 3 thời điểm thí nghiệm (xử lí mặn sau 1 giờ, 6 giờ và 12 giờ . Chúng tôi không thể tìm thấy các dẫn liệu biểu hiện trong điều kiện mặn của hầu hết các gene thuộc họ TF SRF ngoại trừ gene Glyma11g26260 c biểu hiện. Nhƣ vậy, sau khi tiến hành phân tích biểu hiện các TF trong điều kiện xử lí mặn c 5 gene đáp ứng rất mạnh gồm 1 gene bHLH (Glyma13g19250), 3 gene bZIP và 1 gene SRF (Glyma11g26260)
31
c biểu hiện đáp ứng phiên mã tăng mạnh khi xử lí mặn. Đặc biệt các gene thuộc TF bZIP đều đều đƣợc tăng cƣờng biểu hiện mạnh ở rễ trong cả điều kiện thƣờng và điều kiện xử lí mặn.
32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1.Kết luận
Các phân tử protein thuộc họ bHLH c kích thƣớc trung bình khá lớn, c độ linh hoạt thấp. Đối với họ bZIP và SRF c kích thƣớc và trọng lƣợng
nhỏ, c độ linh hoạt cao dễ dàng đƣợc xuất hoặc nhập qua màng tế bào để
thực hiện chức năng sinh học. Ngoài ra, các gene thuộc họ bHLH, bZIP, SRF c thể cƣ trú ở rất nhiều vị trí để thực hiện chức năng điều h a trong tế bào. Tất cả protein trong nghiên cứu đều là những proetin ƣa nƣớc và có khả năng chịu nhiệt.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã xác định đƣợc 15 trên tổng số 21 protein thuộc 3 họ TF c hàm lƣợng Met phân bố nhiều quanh v ng bảo thủ.
Có 15 gene c biểu hiện ở ít nhất là một mô trong điều kiện thƣờng. Họ bHLH có 4 gene biểu hiện mạnh ở hoa và lá, c thể tham gia vào quá trình sinh trƣởng và phát triển. Họ bZIP thì biểu hiện rất mạnh ở các bộ phân dƣới mặt đất. Các gene thuộc họ SRF hầu hết đều biểu hiện ở dƣới ngƣởng phát hiện. Sau khi tiến hành xử lí mặn thì c 10 gene biểu hiện, trong đ c 5 gene
đáp ứng mạnh gồm 1 gene bHLH (Glyma13g19250), 3 gene bZIP và 1 gene
SRF (Glyma11g26260).
2.Đề xuất
Đề nghị cần tiếp tục phát triển nghiên cứu này trên thực nghiệm nh m tăng độ tin cậy cho giả thuyết trên và đánh giá tính chống chịu mặn của một số gene thuộc 3 họ TF đặc biệt là đối với TF bZIP gồm 3 gene
Glyma02g01600, Glyma08g12170, Glyma05g28960đã đƣợc xác định là quan trọng từ dẫn liệu đƣợc khai thác.
33
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN KHÓA LUẬN
Chu Đức Hà, La Việt Hồng, Lê Minh Tuấn, Phạm Phƣơng Thu, Phạm Thị Lý Thu (2019 , “Phân tích vai tr của gốc methionine trong cấu trúc họ nhân tố phiên mã ở cây đậu tƣơng (Glycine max ”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam (Chấp nhận đăng .
34
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1] Chu Hoàng Mậu (2013 , “ Đặc điểm của gen Expansin phân lập từ giống đậu địa phƣơng Việt Nam”,Tạp chí sinh học số, 35(1), 99-104.
[2] Ngô Thế Dân (1999), Cây đậu tương,NXB Nông nghiệp Hà Nội.
[3] Nguyễn Thị Hiền và Vũ Thị Thƣ (2004 , Hóa Sinh học, NXB Đại học Sƣ phạm.
[4] Lê Quý Đôn (2006 , Vân Đài loại ngữ, NXB Văn h a thông tin.
[5] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa hoc kỹ thuật Hà Nội.
[6] Trần Văn Điền (2007), Giáo trình cây đậu tương, NXB Nông nghiệp Hà Nội.
Tài liệu tiếng Anh
[7] Atchley, W.R., Fitch, W.M., (1997), “ A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors”, Proc Natl Acad Sci USA,( 94), 5172-5176.
[8] Arumuganathan, K., and Earle, E.D., (1991 , “Nuclear DNA content of some important plant species”, Plant Molecular Biology Reporter, (9), 208-219.
[9] Brosnan, J.T., Brosnan, M.T., (2006 , “The sulfur-containing amino acids: an overview”, J Nutr, 136 (6 Suppl): 1636s-1640s.
[10]Brivanlou, A.H., James, E., Darnell, Jr., (2002 , “Signal transduction and the control of gene expression", Science, (295), 813.
[11]Belamkar, V., Weeks, T.M., Bharti, K.A., Farmer, D.A., Garham, A.M., and Cannon, B.S., (2014 , “Comprehensive characterization and RNA- Seq profiling of the HD-Zip transcription factor family in soybean
(Glycine max during dehydration and salt stress”, BMC Genomics, 15, 950.
35
[12]Chen, L., Song, Y., Li, S., Zhang, L., Zou, C., Yu, D., (2012), “The role of WRKY transcription factors in plant abiotic stresses”, Biochim Biophys Acta, (1819), 120-128.
[13] Ellenberger, T., Fass, D., Arnaud, M., Harrison, S.C., (1994 , “Crystal structure of transcription factor E47: E-box recognition by a basic region helix-loophelix dimer”, Genes Dev, (8), 970–980.
[14] Emanuelsson, O., Brunak, S., Heijne, G.V., Nielsen, H., (2007), “Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools”,
Nat Protoc, 2(4), 953-971.
[15]Gurley, W.B., Hepburn, A.G., & Key, J.L., (1979 , “Sequence organization of the soybean genome”, Biochim Biophys Acta, (561), 167- 183.
[16]Goldberg, R.B., (1978 , “ DNA sequence organization in the soybean plant”, Biochem Genet, 16, 45-68.
[17]Gasteiger, E., Gattiker, A., Hoogland, C., Ivanyi, I., Appel, R. D., Bairoch, A., (2003), “ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis”. Nucleic Acids Res, 31(13): 3784-3788. [18] Hymowitz, T., (1970 , “On domestication of Soybean”, Econ Bot, (24),
408-421.
[19] Hymowitz, T., (2004), “Speciation and cytogenetics”. p. 97-136. In H. R. Boerma, J. E. Specht (eds.).Soybeans: improvement, production, and uses. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, and Soil Science Society of America, Madison, WI, Agronomy Series, no. 16, 1180 p.
[20]Hudson, K.A., Hudson, M.E., (2015 , “A classification of basic helix- loop-helix transcription factors of soybean”, Int J Genomics, (2015), 603-182.
36
[21]Ha, D.C., Quynh, N.L., Huy, Q.N., Dung, T.L., (2016), Genome-wide analysis of genes encoding methionine-rich proteins in Arabidopsis and Soybean suggesting their roles in the adaptation of plants to abiotic stress, Int J Genomics, (2016),1-8.
[22] Hall, T.A., (1999), “BioEdit: A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT”, Nucleic Acids Symp Ser, 41, 95-98.
[23]Jakoby, M., B. Weisshaar, W. Dröge-Laser, J. VicenteCarbajosa, J. Tiedemann, T. Kroj and F. Parcy, (2002), bZIP transcription factors in arabidopsis. Trends Plant Sci, (7),106-111.
[24]Kiraga, J., Mackiewicz, P., Mackiewicz, D., Kowalczuk, M., Biecek, P., Polak, N., Smolarczyk, K., Dudek, M.R., Cebrat, S., (2007), “The relationships between the isoelectric point and: length of proteins, taxonomy and ecology of organisms", BMC Genomics, (8), 163.
[25]Koc, A.B., Abdullah, M., Fereidouni, M., (2011 , “Soybean - Applications and Technology”, Published by InTech.
[26]Kilian, J., Peschke, F., Berendzen, K.W., Harter, K., Wanke, D., (2012) “Prerequisites, performance and profits of transcriptional profiling the abiotic stress response”,Biochim Biophys Acta, (1819), 166–175.
[27]Kim, G., Stephen, J.W., (2014), “Methionine oxidation and reduction in proteins”,J Biol Chem, 293(19), 7355-7366.
[28] Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K., (2016), “MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets”, Mol Biol Evol, 33(7),1870-1874.
[29]Lackey, J.A., (1980 , “Chromosome numbers in the phaseoleae
(Fabaceae:Faboideae and there relation to taxonomy”, Am J Bot, 67 (4), 595-602.
[30]Le, D.T., Nishiyama, R., Watanabe, Y., Mochida, K., Kazuko Yamaguchi-Shinozaki, Shinozaki, K., and Tran, L.S.P., (2011),
37
“Genome-wide survey and expression analysis of the plant-specific NAC transcription factor family in Soybean during development and dehydration stres”, DNA Res, 18(4), 263-76.
[31]Latchman, D.S., (1997 , “Transcription factor : An overview”, Int J Biochem Cell Biol, 29(12), 1305-1312.
[32]Levine, R.L., Mosoni, L., Berlett, B.S., Stadtman, E.R., (1996), “Methionine residues as endogenous antioxidants in proteins”, Proc Natl Acad Sci USA, 93(26), 15036-40.
[33] Li, X., Duan, X., Jiang, H., Sun, Y., Tang, Y., Yuan, Z., Guo, J., Liang, W., Chen, L., Yin, L., Ma, H., Wang, J., and Zhang, D., (2006), “Genome-Wide analysis of basic/helix-loop-helix transcription factor family in rice and arabidopsis”, Plant Physiol, (141), 1167–1184.
[34] Libault, M., Farmer, A., Joshi, T., Takahashi, K., Langley, J.R., Farnklin, D.L., Xu, D., May, G., and Stacey, G., (2010 , “An integrated transcriptome atlas of the crop model Glycine max, and its use in
comparative analyses in plants”, Plant J, (63), 86-99.
[35] Ledent, V., Vervoort, M., (2001 , “The basic helix – loop – helix protein family: comparative genomeics and phylogenetic analysis”, Genome Res, 11(5), 754-70.
[36]Murre, C., McCaw, P.S, Baltimore, D., (1989), “A new DNA binding and dimerization motif in immunoglobulin enhancer binding, daughterless, MyoD, and myc proteins”,Cell, (56), 777-783.
[37]Nakashima, K., Y. Ito and K. Yamaguchi-Shinozaki, (2009),
“Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses”, Plant Physiol (149), 88-95.
[38] Nesi, N., Debeaujon, I., Jond, C., Pelletier, G., Caboche, M., Lepiniec, L., (2000), “The TT8 gene encodes a basic helix-loop-helix domain
38
protein required for expression of DFR and BAN genes in Arabidopsis siliques”, Plant Cell, (12), 1863–1878.
[39]Quach, T.N., Nguyen, H.T.M., Valliyodan, B., Joshi, T., Xu, D., Nguyen, T.H., (2014 , “Genome-wide expression analysis of soybean NF-Y genes reveals potential function in development and drought response”, Mol Genet Genomics, 290(3),1095-115.
[40]Quail, P.H., Huq, E., (2002 , “PIF4, a phytochrome-interacting bHLH factor, functions as a negative regulator of phytochrome B signaling in Arabidopsis”, EMBO J, 21(10), 2441-2450.
[41]Ramsay, N.A., Glover, B.J., (2005 , “ MYB-bHLH-WD40 protein complex and the evolution of cellular diversity”, Trends Plant Sci, (10), 63–70.
[42]Ravanel, S., Gkière, B., Job, D., and Douce, R., (1998 , “The specific features of methionine biosynthesis and metabolism in plants”, Proc Natl Acad Sci USA, (95), 7805-7812.
[43]Rushton, D.L., Tripathi, P., Rabara, R.C., Lin, J., Ringler, P., Boken, A.K., Langum, T.J., Smidt, L., Boomsma, D.D., Emme, N.J., Chen, X., Finer, J.J., Shen, Q.J., Rushton, P.J., (2012 , “WRKY transcription