2.3.1. Phương pháp định lượng esomeprazol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đƣợc xây dựng để định lƣợng hàm lƣợng dƣợc chất trong pellet, xác định độ hòa tan dƣợc chất từ các mẫu pellet.
Điều kiện sắc ký:
Qua tài liệu tham khảo [21], lựa chọn điều kiện sắc kí nhƣ sau: Cột C18 (15 cm * 4,6 cm * 5 μm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bƣớc sóng 280 nm. Pha động: đệm phosphat pH 7,6 – Acetonitril (65:35) (tt/tt). Tốc độ dòng: 1 mL/phút.
Thể tích tiêm mẫu: 20 μl.
Chuẩn bị dung dịch pha loãng (A): 0,52 g Na3PO4.12H2O và 1,97 g Na2HPO4 hòa tan vào nƣớc cất thành 1000 ml dung dịch đệm, điều chỉnh về pH 11 bằng dung dịch NaOH hoặc H3PO4.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 0,0625 g EMZ, hòa tan bằng methanol trong bình định mức 50 ml thu đƣợc dung dịch gốc có nồng độ khoảng 1,25 mg/ml. Pha loãng dung dịch gốc bằng dung dịch A đến các nồng độ 5, 50, 100, 125, 200 µg/ml. Các dung dịch chuẩn đƣợc lọc qua màng lọc 0,2 µm.
Đánh giá chỉ tiêu:
Để đảm bảo độ tin cậy của phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC, tiến hành đánh giá các chỉ tiêu:
Độ tuyến tính: tiêm lần lƣợt các dung dịch chuẩn theo thứ tự nồng độ tăng dần. Lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ EMZ với hệ số tƣơng quan R2≥0,995.
Độ đúng và độ lặp lại: tiến hành thẩm định độ đúng, độ lặp lại trên ba nồng độ 5 µg/ml; 100 µg/ml; 200 µg/ml. Lặp lại 6 mẫu đối với mỗi nồng độ. Xác định nồng độ mỗi mẫu dựa vào diện tích pic thu đƣợc và đƣờng chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Độ
20
đúng đƣợc xác định bằng cách so sánh nồng độ tính đƣợc với nồng độ thực của mẫu. Độ lặp lại đƣợc xác định thông qua giá trị RSD.
2.3.2. Phương pháp bào chế pellet kích thước nhỏ esomeprazol
2.3.2.1. Phương pháp bào chế pellet chứa dược chất
Pellet chứa dƣợc chất đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp bồi dần trên thiết bị tầng sôi. Trong phƣơng pháp này, hỗn dịch dƣợc chất với tá dƣợc đƣợc phun lên nhân trơ để hình thành pellet nhân chứa dƣợc chất.
Bảng 2.3 Công thức dịch bồi lớp dƣợc chất Thành phần Lƣợng
Esomeprazol trihydrat magnesi 15% (kl/tt)
HPMC E606 4% (kl/tt)
Mg(OH)2 0.5% (kl/tt)
Tween 80 1% (kl/tt)
Dung môi Đệm phosphate pH 11
Chuẩn bị dịch bao: Sử dụng một phần dung môi để ngâm trƣơng nở HPMC E606, sau đó phân tán Tween 80. Dƣợc chất và Mg(OH)2 đƣợc nghiền, trộn đồng lƣợng trong cối sứ rồi nghiền ƣớt với dịch HPMC thu đƣợc hỗn dịch đặc và chuyển sang máy khuấy từ. Dùng phần dung môi còn lại kéo dần hỗn hợp còn trong cối vào hỗn dịch đặc, khuấy từ cho đồng nhất. Lọc dịch qua rây 0,180 mm. Tiếp tục khuấy từ 30 phút để ổn định dịch bồi.
Quá trình bao: Sấy nhân trơ trong khoảng 15 phút ở nhiệt độ thích hợp, sau đó tiến hành bồi dần với các thông số kỹ thuật nhƣ trong phụ lục 2.
Công thức tính hiệu suất quá trình bao H:
Trong đó: a là khối lƣợng pellet sau bồi, b là khối lƣợng nhân trơ ban đầu, c là khối lƣợng chất rắn trong dịch bồi.
Công thức tính bề dày màng bao D:
21
Trong đó: mpellet trƣớc bồi là khối lƣợng pellet trƣớc bồi, mpellet sau bồi là khối lƣợng pellet sau bồi.
2.3.2.2. Phương pháp bồi lớp cách li
Pellet bao cách li đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp bồi dần trên thiết bị tầng sôi. Trong phƣơng pháp này, hỗn dịch polyme với tá dƣợc đƣợc phun lên pellet chứa dƣợc chất để hình thành pellet bao cách li.
Bảng 2.4 Công thức màng bao cách ly cho pellet Thành phần Lƣợng
HPMC E606 5%
Talc 6%
Dung môi Nƣớc
Chuẩn bị dịch bao: Sử dụng một phần dung môi để ngâm trƣởng nở HPMC E606, Talc đƣợc rây qua rây 0,180 mm, nghiền ƣớt trong cối sứ với dịch HPMC thu đƣợc hỗn dịch đặc và chuyển sang máy khuấy từ. Dùng phần dung môi còn lại kéo dần hỗn hợp còn trong cối vào hỗn dịch đặc, khuấy từ cho đồng nhất. Lọc dịch qua rây 0,180 mm. Tiếp tục khuấy từ 30 phút để ổn định dịch bồi.
Quá trình bồi lớp cách li: Sấy pellet chứa dƣợc chất trong khoảng 15 phút ở nhiệt độ thích hợp, sau đó tiến hành bồi dần với các thông số kỹ thuật nhƣ trong phụ lục 2.
2.3.2.3. Phương pháp bao màng bao tan tại ruột
Pellet bao lớp bao tan tại ruột đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp bồi dần trên thiết bị tầng sôi. Trong phƣơng pháp này, hỗn dịch polyme với tá dƣợc đƣợc phun lên pellet đã đƣợc bao cách li để hình thành pellet hoàn chỉnh.
Bảng 2.5 Công thức lớp bao tan tại ruột Thành phần Lƣợng
Eudragit D30D-55 62,5 g
Talc 2,81 g
Chất hóa dẻo Khảo sát
22
Chuẩn bị dịch bao: Talc đƣợc rây qua rây 0,180 mm. Phân tán chất hóa dẻo và talc vào nƣớc. Sau đó thêm Eudragit L30D-55 vào hỗn hợp trên, Lọc dịch bao qua rây 0,180 mm. Tiếp tục khuấy từ 30 phút để ổn định dịch bao.
Quá trình bao màng tan tại ruột: Sấy pellet đã đƣợc bao cách li trong khoảng 15 phút ở nhiệt độ thích hợp, sau đó tiến hành bồi dần với các thông số kỹ thuật nhƣ trong phụ lục 2.
2.3.3. Phương pháp bào chế viên nén pellet kích thước nhỏ esomeprazol
Bào chế cốm chứa pellet: Trộn pellet, tá dƣợc độn, tá dƣợc rã trong cối bằng mica. Tá dƣợc dính đƣợc hòa tan hoặc ngâm trƣơng nở trong dung môi, sau đó thêm vào hỗn hợp bột trên, nhào ẩm bằng tay.Xát hạt quay rây 1 mm. Sấy ở 50oC trong khoảng 60 – 90 phút tới độ ẩm 3 – 5%. Sửa hạt qua rây 1 mm.
Dập viên: Rây tá dƣợc trơn qua rây 0,180 mm. Trộn cốm chứa pellet với tá dƣợc trơn 3 phút trong túi nilon. Cân 0,5 g cốm sau khi trộn tá dƣợc trơn, dập viên bằng máy dập thủy lực ở các mức lực khác nhau.
2.3.4. Phương pháp đánh giá tính toàn vẹn của màng bao sau khi dập viên
2.3.4.1. Phương pháp đánh giá tính chất của lớp màng bao polyme
a) Phƣơng pháp đánh giá tính chất cơ học của lớp màng bao polyme
Tạo phim: Phun hỗn dịch tạo màng bao tan ruột, đƣờng kính đầu súng phun 1 mm lên tấm PVC tròn bán kính 9 cm đặt trong đĩa petri thu đƣợc film. Độ dày film đƣợc tính theo phần trăm khối lƣợng tăng lên của tấm PVC. Sấy ở 40oC trong 24h. Sau đó để trong bình hút ẩm ít nhất 48h trƣớc khi tiến hành đánh giá.
Đánh giá tính chất vật lý của phim: Sử dụng thiết bị Texture Analyzer TA.XT với đầu kim loại có gắn bán cầu đƣờng kính 5mm, tốc độ đầu kim loại đi xuống là 0.5mm/s.
Lực đâm và độ dãn của màng tại điểm nứt gãy được tính như sau:
Trong đó: F là tải (kg), A là diện tích phim trong lỗ (m2).
23
Trong đó: R là bán kính của lỗ (11 mm), D là quãng đƣờng dịch chuyển của đầu kim loại từ khi chạm màng đến điểm nứt gãy.
Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo bộ cố định màng phim sử dụng trong thì nghiệm đánh giá tính chất cơ học của màng phim
b) Phƣơng pháp quét nhiệt lƣợng vi sai
Cân các mẫu cần khảo sát khoảng 7 10 mg vào đĩa có nắp đục lỗ. Dùng thiết bị để dập kín và đƣa vào buồng máy. Mẫu đối chiếu đƣợc chuẩn bị là đĩa rỗng có đục hai lỗ để phân biệt. Dùng kẹp đƣa hai đĩa nhôm vào buồng gia nhiệt của thiết bị METTLER TOLEDO. Qua tham khảo các tài liệu [43], chƣơng trình gia nhiệt thiết kế tiến hành theo 3 giai đoạn, trong điều kiện có dòng khí nitơ 50 ml/phút. Tốc độ gia nhiệt đƣợc khảo sát từ 5-30oC để lựa chọn tốc độ gia nhiệt thích hợp. Kết quả đƣợc xử lý trên phần mềm STARe Software.
Giai đoạn một: 30°C - 100°C, giữ ở 100°C trong 15 phút. Giai đoạn hai: 100°C - 10°C.
Giai đoạn ba: 10°C - 150°C.
Xác định nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh của polyme ở giai đoạn 3.
2.3.4.2. Phương pháp đánh giá độ ổn định trong môi trường acid pH 1.2
Sử dụng thiết bị thử độ hòa tan ERWEKA để đánh giá độ ổn định của pellet trong môi trƣờng acid. Qua tài liệu tham khảo [18], lựa chọn điều kiện thử nhƣ sau:
24 Nhiệt độ: 37oC
Tốc độ khuấy: 100 vòng/ phút
Yêu cầu: Thời gian pellet biến màu trong môi trƣờng acid pH 1.2 của viên nén chứa pellet kích thƣớc nhỏ esomeprazol không nhỏ hơn 120 phút.
2.3.4.3. Đánh giá hình thái tiểu phân sử dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM - Scanning Electron Microscope)
Nguyên tắc: chùm điện từ quét trên toàn bộ bề mặt mẫu đƣợc thu lại bởi các đầu dò để biến đổi thành những tín hiệu phản ánh bề mặt và thành phần của mẫu đƣa ra màn hình quan sát.
Cách tiến hành: Phân tán mẫu pellet trên một khung carbon, sau đó phủ một lớp platin mỏng rồi đặt vào buồng soi mẫu của thiết bị. Sử dụng kính hiển vi điện tử FESEM Hitachi S – 4800 có độ phóng đại M = 20x – 80000x; độ phân giải δ = 1,0 nm; điện áp gia tốc U = 0,5 – 3,0 kV.
2.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng của viên nén chứa pellet
Sử dụng thiết bị thử độ hòa tan ERWEKA để đánh giá khả năng giải phóng dƣợc chất của pellet. Qua tài liệu tham khảo [42], lựa chọn điều kiện thử nhƣ sau:
Thiết bị hòa tan: kiểu cánh khuấy.
Thể tích môi trƣờng: 300 ml dung dịch acid HCl 0,1 N (pH 1,2) trong 2 giờ đầu, 30 phút tiếp theo chuyển sang môi trƣờng pH 6,8 bằng cách thêm 700 ml dung dịch Na2HPO4 0,086 M.
Tốc độ khuấy: 100 vòng/phút. Nhiệt độ môi trƣờng: 37 ± 0.5oC.
Tiến hành: cho 1 viên nén chứa pellet kích thƣớc nhỏ esomeprazol vào cốc thử hòa tan. Tiến hành thử với các điều kiện đã nêu ở trên, lấy mẫu ở các thời điểm 120, 135, 150 phút. Tại mỗi thời điểm hút 6 ml dịch hòa tan ra khỏi cốc để tiến hành định lƣợng (bù lại 6 ml môi trƣờng vào cốc sau mỗi lần hút).
Xử lý mẫu:
Thời điểm 120 phút: hút chính xác 5,0 ml dịch hòa tan cho vào lọ thủy tinh có chứa 3,0 mL dung dịch NaOH 0,25 M, lắc đều. Lọc dịch qua màng lọc 0,2 μm thu đƣợc dung dịch mẫu thử.
25
Các thời điểm còn lại: hút chính xác 5,0 ml dịch hòa tan cho vào lọ thủy tinh có chứa 1,0 ml dung dịch NaOH 0,25 M, lắc đều. Lọc dịch qua màng lọc 0,2 μm thu đƣợc dung dịch mẫu thử.
Mẫu chuẩn: pha dung dịch EMZ chuẩn nồng độ Cc mg/ml (với Cc khoảng 1 mg/ml). Sau đó tiến hành xử lý song song nhƣ dung dịch mẫu thử.
Dùng phƣơng pháp HPLC để định lƣợng các dung dịch thử và chuẩn. Phần trăm EMZ giải phóng tại các thời điểm đƣợc tính nhƣ sau:
( ∑
)
Trong đó:
Sc, St (t=1, 2, 3) lần lƣợt là diện tích pic của mẫu chuẩn; mẫu thử tại các thời điểm 120, 135, 150 phút (mAU.s).
Cc là nồng độ dung dịch EMZ chuẩn (mg/ml).
V1 là thể tích môi trƣờng hòa tan trong cốc (t=1 V1= 300 ml; t=2, 3 V= 1000 ml). V2 là thể tích mẫu hút ra tại các thời điểm (V2=6 ml).
m là khối lƣợng pellet cho vào cốc hòa tan (mg). h là hàm lƣợng EMZ trong pellet (%).
Yêu cầu: Do chƣa có chuyên luận riêng cho viên nén chứa pellet EMZ trong Dƣợc điển, đề tài tham khảo yêu cầu từ chuyên luận viên nang (chứa pellet) EMZ trong USP 40. Yêu cầu 30 phút trong pH 6,8 không có dƣới 75% dƣợc chất đƣợc giải phóng.
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý các số liệu thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Xử lý kết quả phân tích DSC bằng phần mềm OriginPro 2018.
26
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Phƣơng pháp định lƣợng esomeprazol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đƣợc xây dựng để xác định hàm lƣợng, độ hòa tan của dƣợc chất từ các mẫu pellet bào chế và chế phẩm đối chiếu. Kết quả đánh giá chỉ tiêu độ tuyến tính, độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp nhƣ sau:
3.1.1. Độ tuyến tính
Tiến hành tiêm lần lƣợt năm mẫu chuẩn nồng độ từ 5 µg/mL đến 200 µg/mL, diện tích pic sắc kí thu đƣợc của các mẫu đƣợc thể hiện trong bảng 3.1:
Bảng 3.1 Mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ EMZ
Nồng độ EMZ (μg/mL) 5 50 100 125 200
Diện tích pic (mAU.s) 242,7 1709,5 2992,4 3707,2 5712
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ esomeprazol Nhận xét: Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ từ 5 đến 200 (µg/mL), đƣờng biểu diễn mối tƣơng quan giữa diện tích pic và nồng độ EMZ là một đƣờng tuyến tính có phƣơng trình hồi quy là y = 27.766 x + 207.19; hệ số tƣơng quan = 0,9984 > 0,995. Nhƣ vậy trong khoảng nồng độ này, diện tích pic phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ esomeprazol. y = 27.766x + 207.19 R² = 0.9984 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 0 50 100 150 200 250 Diện tích pic (m AU.s) Nồng độ EMZ (μg/mL)
27
Kết luận: Sau khi tiến hành định lƣợng EMZ bằng HPLC cho thấy trong khoảng nồng độ 5 đến 200 µg/mL, diện tích pic phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ EMZ. Do đó có thể sử dụng phƣơng pháp này để định lƣợng EMZ trong các mẫu thử.
3.1.2. Độ đúng và độ lặp lại
Tiến hành đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp trên ba nồng độ 5 µg/mL; 100 µg/mL; 200 µg/mL, mỗi nồng độ lặp lại sáu lần. Kết quả đo thực tế đƣợc thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Độ đúng và độ lặp lại của phƣơng pháp HPLC
Thứ tự Nồng độ 5 µg/mL Nồng độ 100 µg/mL Nồng độ 200 µg/mL Nồng độ tính toán Nồng độ thực Độ đúng Nồng độ tính toán Nồng độ thực Độ đúng Nồng độ tính toán Nồng độ thực Độ đúng 1 5,88 5,20 113,00 112,02 111,00 100,92 196,45 196,00 100,23 2 5,95 5,30 112,21 116,73 115,00 101,50 201,27 204,00 98,66 3 6,05 5,30 114,07 116,56 115,00 101,35 233,19 228,00 102,28 4 5,95 5,25 113,28 111,93 113,00 99,06 233,17 228,00 102,27 5 4,96 4,30 115,46 99,98 100,00 99,98 239,40 236,00 101,44 6 4,96 4,30 115,46 99,87 101,00 98,89 239,21 234,00 102,23 TB 113,91 100,28 101,18 SD 1,34 1,15 1,47 RSD 1,18 1,14 1,45 Chú thích: Nồng độ (µg/mL) Độ đúng (%)
Nhận xét: Kết quả trong bảng 3.2 cho thấy ở cả ba nồng độ, phƣơng pháp có độ đúng trong khoảng từ 98,66 % đến 115,46 %. Độ lặp lại của phƣơng pháp có RSD < 2%, đáp ứng đƣợc yêu cầu của phƣơng pháp phân tích (phụ lục 3).
Kết luận: Sau khi tiến hành đánh giá ba chỉ tiêu độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, thấy đƣợc độ tin cậy của phƣơng pháp HPLC trong định lƣợng EMZ. Do đó có thể áp dụng phƣơng pháp này để định lƣợng EMZ trong mẫu thử.
28
3.2. Tính chất của lớp màng bao polyme
Khi tiến hành dập viên với pellet esomeprazol, cả pellet lẫn lớp màng bao tan trong ruột đều chịu một lực nhất định dẫn đến biến dạng, thậm chí là nứt vỡ, làm mất đặc tính giải phóng dƣợc chất mong muốn. Do đó, màng polyme cần có khả năng chịu nén tốt, có thể đánh giá gián tiếp thông qua các tính chất của màng.
3.2.1. Tính chất cơ học của lớp màng bao polyme
Tiến hành tạo màng polyme nhƣ mục 2.3.4.1.a với các công thức màng bao tan trong ruột đƣợc trình bày trong bảng 3.3, sau đó đánh giá tính chất cơ học của lớp màng bao polyme theo quy trình tại mục 2.3.4.1.a. Kết quả đƣợc trình bày tƣơng ứng trong bảng 3.3.
Bảng 3. 3 Công thức và tính chất cơ học của màng bao polyme
Thành phần
Công thức màng bao polyme
F1 F2 F3 F4 F5 F2.1 F2.2 F2.3 Eudragit L30D-55 62,5 g 62,5 g 62,5 g 62,5 g 62,5 g 62,5 g 62,5 g HPMC E606 - - - - TEC - 3,75 g 3,75 g 3,75 g - 2,81 g 1,88 g DBP - - - - 3,75 g - - Talc - 2,81 g 2,81 g 2,81 g 2,81 g 2,81 g 2,81 g