2.3.5.1. Hoạt hóa chủng nấm mốc và giữ giống trong ống nghiệm
Đổ môi trường Crapeck lên đĩa petri, sử dụng que cấy đã khử trùng bằng cồn cấy chuyển bào tử nấm từ ống nghiệm ra đĩa thạch bằng phương pháp cấy chấm điểm.Sau đó đem đĩa đặt trong tủ ấm nuôi ở điều kiện nhiệt độ 30oC trong 3 – 5 ngày.
2.3.5.2. Nhân giống chủng A. niger
Sử dụng bình tam giác có dung tích 100ml chứa 20ml môi trường nhân giống.
Sử dụng que cấy để cấy chuyển nấm (bào tử) từ trên đĩa thạch vào trong bình tam giác (chú ý đo OD để xác định lượng các bào tử bằng nhau). Nuôi trong điều kiện môi trường lắc ở 150 vòng/phút ở nhiệt độ 30oC. Sau 3 ngày nuôi cấy, thu nhận hệ sợi (pellet) của các chủng A. niger đưa vào lên men.
2.3.5.3. Điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp pectinase từ A.niger
Chủng A.niger CF2 được nuôi lắc trong môi trường Crapeck ở 30oC.Sau 3 ngày, cấp giống vào bình tam giác chứa cơ chất cám – trấu tỷ lệ (7:2) với tỷ lệ 2.106 bào tử/g môi trường.
Hàm lượng pectin: được khảo sát ở các nồng độ 8, 12, 16% (w/w) tương ứng với độ ẩm 50%, sau 3 ngày nuôi ở 30oC mẫu được đánh giá hoạt độ enzyme.
Độ ẩm môi trường: được khảo sát ở các mốc 50, 60, 70% (w/w) khi nuôi chủng thí nghiệm trong bình 250ml chứa 16g môi trường có bổ sung 12% (w/w) pectin.
Nhiệt độ: được thử nghiệm với các mốc nhiệt độ 24, 30, 37oC trong 16g môi trường bổ sung 12% pectin và độ ẩm 60%.
Thời gian lên men: chủng được lên men theo các điều kiện thích hợp tìm được ở trên, định kì các khoảng thời gian 3, 5 và 7 ngày, mẫu canh trường được xác định hoạt độ pectinase.
Các bố trí thí nghiệm nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp Pectinase được biểu diễn ở bảng 2.1.
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu các điều kiện thích hợp sinh tổng hợp Pectinase STT Hàm lượng pectin (%) Độ ẩm (%) Nhiệt độ (oC)
Thời gian lên men (giờ) 1 8 60 30 72 2 12 3 16 4 Hàm lượng pectin thích hợp 50 30 72 5 60 6 70 7 Hàm lượng pectin thích hợp Độ ẩm thích hợp 24 72 8 30 9 37 10 Hàm lượng pectin thích hợp Độ ẩm thích hợp Nhiệt độ thích hợp 72 11 120 12 168
Hình 2.1: Môi trường lên men trước khi được bổ sung dịch khoáng
2.3.5.4. Thu dịch enzyme thô
Dịch enzyme được chiết tách bằng đệm phosphate pH 4,5 (tỷ lệ chiết đệm: môi trường nuôi là 7:1) trên máy lắc 200 vòng/ phút trong 1 giờ, lọc qua
vải màn sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No1. Dịch sau khi lọc được ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 20 phút ở 4oC và thu dịch nổi (enzyme thô).
2.3.5.5. Kết tủa enzyme bằng ethanol
Dịch enzyme sau khi ly tâm được sổ sung ethanol lạnh (0oC) theo tỷ lệ 1:3, để dịch ổn định 2 tiếng ở 0o – 4oC, sau đó ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4oC. Hòa tan kết tủa trong đệm pH 4,5 và xác định hoạt độ Pectinase.
2.3.5.6. Định lượng đường khử bằng DNS
Đường khử được xác định theo phương pháp của Miller G.L (1959)
- Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường
khử với thuốc thử acid dinitro salisilic. Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Biết được mật độ quang của dịch đường khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn monogalacturonan suy ra hàm lượng đường khử của dịch nghiên cứu.
- Cách tiến hành: Lập đường chuẩn: pha các mẫu đường monogalacturonan có nồng độ xác định rồi cho 200 µl dịch phản ứng với 1 ml thuốc thử DNS trong thời gian 10 phút. Kết quả được đem đo mật độ quang ở bước sóng 575nm. Từ đó lập ra được đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng đường monogalacturonantrong mẫu với mật độ quang OD.
Kết quả xây dựng đường chuẩn monogalacturonan được biểu diễn trong đồ thị dưới đây:
Từ đồ thị trên, có thể tính được nồng độ đường khử trong mẫu từ giá trị mật độ quang theo phương trình sau:
x =y+ba (mg/ml)
Trongđó: x: hàm lượng đường có trong mẫu (mg/ml) y: giá trị mật độ quang (OD)
2.3.5.7. Xác định hoạt độ Pectinase
Hoạt độ Pectinase được xác định với cơ chất pectin. Phản ứng enzyme được thực hiện với 180 µl dung dịch pectin 1% (w/v) và 20 µl dung dịch enzyme (được pha loãng tới nồng độ thích hợp), ở 50oC trong 10 phút. Dừng phản ứng bằng 1 ml dung dịch DNS và đun sôi trong 10 phút. Tiếp đến, li tâm hỗn dịch phản ứng ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút (cho loại cặn nếu có). Đo độ hấp thụ ở bước sóng 575 nm. Dựa vào đồ thị đường chuẩn acid galacturonic với thuốc thử DNS để xác định hoạt độ enzyme.
Một đơn vị hoạt độ Pectinase là lượng enzyme cần thiết để xúc tác chuyển hóa pectin tạo thành 1 µmol acid galacturonic trong thời gian 1 phút ở những điều kiện hoạt động thích hợp của enzyme.
Hoạt độ pectinase được xác định bằng công thức: H = X∗600f∗1000
∗t (U/ml)
Trong đó: X: hàm lượng đường khử sau thủy phân (mg/ml) f: hệ số pha loãng
1000: hệ số quy đổi
600: khối lượng phân tử pectin t: thời gian thủy phân (10 phút)
2.3.5.8. Khảo sát đặc tính của Pectinase
Nhiệt độ tối ưu của enzyme được tiến hành theo phương pháp xác định hoạt độ Pectinase ở các nhiệt độ khác nhau trong khoảng từ 30 – 70oC. Để khảo sát độ bền nhiệt, enzyme được ủ trong dung dịch đệm citrate photphat
0,1M pH 4,5 ở các nhiệt độ khác nhau (trong khoảng từ 30 - 70oC). Sau những khoảng thời gian 1 – 7 giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ Pectinase còn lại.
Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme được xác định ở nhiệt độ tối ưu của enzyme với cơ chất được pha trong dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có các giá trị pH khác nhau nằm trong khoảng từ pH 3,0 đến 7,0. Để khảo sát độ bền pH, enzyme được pha loãng và ủ ở 40oC với dung dịch đệm trên có các giá trị pH khác nhau, sau những khoảng thời gian 1 – 6 giờ, lấy mẫu xác định hoạt độ Pectinase còn lại (với cơ chất được pha trong dung dịch đệm pH 4,5).
Ảnh hưởng của ion đến hoạt tính enzyme được nghiên cứu bằng cách ủ dung dịch enzyme với các ion kim loại Ca2+, Fe2+, Mn2+ (nồng độ cuối 10 mM) trong đệm cictrate photphat 0,1M (pH 4,5) ở 50oC trong 10 phút, sau đó xác định hoạt độ Pectinase còn lại và so sánh với mẫu không bổ sung ion kim loại (đối chứng).
2.3.5.9. Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp.Các kết quả nghiên cứu là trung bình của 3 lần lặp lại.
CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Hoạt hóa chủng nấm mốc A.niger CF2
A.niger CF2 sau 72 giờ hoạt hóa trong môi trường Czapeck có hình thái hệ sợi và bào tử như hình 3.1. Bào tử hình tròn, màu nâu đậm, mật độ hệ sợi trung bình D=2-3cm có màu trắng đục, dạng hình tròn.
Hình 3.1: A. niger sau 3 ngày nuôi cấy trong tủ ấm ở 30oC
3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinhtổng hợp pectinase tổng hợp pectinase
3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng pectin
Pectin đóng vai trò là cơ chất cảm ứng cho quá trình tổng hợp pectinase. Với phương pháp lên men rắn, lượng pectin sử dụng được khảo sát trong khoảng 8 – 16% (w/w). Sau 3 ngày nuôi, hoạt độ pectinase cao nhất đạt 2,231 U/g ở hàm lượng pectin 12% (w/w) (hình 3.2).
8 12 16 0 0.5 1 1.5 2 2.5
Hình 3.2: Ảnh hưởng của pectin đến hoạt độ pectinase
Kết quả nghiên cứu cũng tương ứng với công bố của nhóm sinh viên thuộc Khoa Tài nguyên Môi trường, Trường Đại học Thủ Dầu Một [1]. Theo báo cáo nghiên cứu, hoạt độ enzyme thu được cao nhất trong môi trường rắn có bổ sung 12% cơ chất pectin.
Hình 3.3: Hỗn hợp (enzyme thu được + pectin 1%) trước khi đo OD
Có thể thấy, ống Efpendort chứa hỗn hợp dung dịch gồm enzyme thu được tại hàm lượng pectin 12% có màu đậm nhất rồi đến ống 16% và ống 8% có màu sáng nhất.
3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường
Độ ẩm môi trường ban đầu có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật khi lên men rắn, do đó ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp các enzyme thủy phân cơ chất. Độ ẩm môi trường sẽ thay đổi liên tục trong quá trình lên men, do vậy việc nghiên cứu độ ẩm cho môi trường rất quan trọng. Độ ẩm thấp sẽ không đủ lượng nước cho nấm sinh trưởng, ngược lại độ ẩm quá cao cũng ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng do độ thoáng khí giảm. Kết quả hình 3.4 cho thấy ở độ ẩm 60% chủng A.niger CF2 cho khả năng sinh tổng hợp pectinase cao nhất đạt 3,422 U/g. Giá trị hàm ẩm 60% cũng được xác định cho chủng A.niger CF2 khi nuôi trên môi trường rắn.
50% 60% 70% 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Hình 3.4: Ảnh hưởng của độ ẩm đến pectinase từ chủng A.niger CF2
Báo cáo của Nazneen Akhter cùng cộng sự cũng cho thấy hoạt độ enzyme pectinase thu được cao nhất với giá trị hàm ẩm 60% [3]
3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của vi sinh vật, mỗi vi sinh vật có thể sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme mục tiêu trong một phạm vi nhất định. Mặc dù, A. niger là chủng nấm mốc hoạt động trong vùng nhiệt độ ưa ấm khoảng 20 – 40oC nhưng qua nghiên cứu tài liệu cho thấy nhiệt độ sinh tổng hợp pectinase của các chủng A. niger rất khác nhau.
Bai ZH và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger ở 30oC cho sinh tổng hợp pectinase[2], trong khi đó Akhter N. và cộng sự lại chọn 40oC cho nuôi cấy A. niger IM-6 [3], Leda R Castilho và cộng sự nuôi cấy A. niger ở 35oC [4].
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của chủng A. niger CF2 được thực hiện trong khoảng 24 - 37oC. Kết quả được thể hiện ở hình 3.5 cho thấy ở nhiệt độ 30oC A. niger CF2 phát triển mạnh nhất và cũng sinh tổng hợp pectinase cao nhất (5,4 U/g). Do đó lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy 30oC cho các nghiên cứu tiếp theo.
24 30 37 0 1 2 3 4 5 6
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt độ enzyme
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men
Thời gian lên men có ảnh hưởng lớn trong sản xuất enzyme. Thời gian lên men để đạt hoạt độ pectinase cao nhất càng ngắn thì chi phí sản xuất càng thấp. Kết quả hình 3.6 cho thấy chủng A. niger CF2 có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao nhất 5,572 U/g sau 72 giờ. Kết quả của Mukesh kumar D J. và cộng sự nuôi cấy chủng A. niger từ chủng Bacillus sp. MFW7 cũng cho hoạt độ pectinase cao nhất sau 72 giờ [8]. Do vậy lựa chọn thời gian nuôi cấy 72 giờ để thu nhận enzyme A. niger CF2 [10][12]
72h 120h 168h 0 1 2 3 4 5 6
Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A.niger CF2
Từ kết quả khảo sát cho thấy 3 thông số hàm lượng pectin, hàm ẩm và nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến hoạt độ peptinase. Với hàm lượng pectin 12%, độ ẩm 60% và nhiệt độ 30oC hoạt độ pectinase thu được cao nhất sau 72 giờ lên men.
3 ngày 5 ngày 7 ngày
Hình 3.7: Môi trường lên men thu enzyme pectinase sau 3,5 và 7 ngày
Ta có thể thấy sau 3 ngày, hệ sợi nấm phát triển và ăn lan khá dày đặc trên bề mặt cơ chất tuy nhiên so với ngày thứ 5, ngày thứ 7; hệ sợi nấm an lan rộng hơn, dày hơn, đâm sâu vào cơ chất hơn nhưng hoạt độ enzyme ở ngày thứ 3 lại cao nhất. Điều đó chứng minh qua những hình ảnh sau khi có sự chênh lệch độ đậm nhạt ở hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%):
3 ngày – màu dung dịch đậm hơn 5 ngày – màu dung dịch nhạt hơn
Hình 3.8: Hỗn hợp dung dịch (enzyme thu được + pectin 1%) sau 3, 5 ngày
3.3. Đặc tính của peptinase từ chủng A. niger CF2
3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền enzyme
pH ảnh hưởng rất rõ rệt đến phản ứng enzyme vì pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và độ bền của enzyme. Vì vậy, tiến hành khảo sát ảnh
hưởng của pH đến hoạt tính pectinase của A. niger CF2 qua đó xác định được pH tối ưu của enzyme.
pH tối ưu của pectinase từ A. niger CF2
Để xác định pH tối ưu, pectinase của chủng A. niger CF2 được phản ứng với cơ chấtđược pha trong dung dịch đệm citrate photphat 0,1M có các giá trị pH khác nhau nằm trong khoảng từ pH 3,0 đến 7,0 trong thời gian 10 phút. Mối quan hệ giữa pH và hoạt độ tương đối của enzyme thu được thể hiện ở hình 14. pH3 PH4 pH5 pH6 pH7 0 1 2 3 4 5 6
Hình 3.9: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme pectinase từ A.niger CF2
Kết quả hình 3.9 cho thấy enzyme pectinase từ chủng A.niger CF2 hoạt động trung vùng pH từ 4 – 5 và hoạt độ enzyme thu được cao nhất pử pH = 5. Ở pH này, hoạt tính của pectinase là tối đa và sự thay đổi pH cao hơn hoặc thấp hơn đều làm hạ thấp đáng kể độ hoạt động của enzyme. Một số tác giả khi nghiên cứu đặc tính của pectinase từ A. niger cũng tìm được dải pH thích hợp cho hoạt tính pectinase nằm trong khoảng từ 3,5 - 5,5 và pH tối ưu là 4,5 – 5,5[04, 05,06,11].
Xác định độ bền pH:
- Khảo sát độ bền pH hoạt tính pectinase bằng cách ủ enzyme ở 40oC trong dung dịch đệm pH từ 3 – 7, sau những khoảng thời gian khác nhau, lấy
mẫu xác định hoạt độ pectinase còn lại (với cơ chất được pha trong dung dịch đệm pH = 4,5). Kết quả thu được thể hiện ở hình 3.10.
0h 1h 2h 3h 4h 5h 0 1 2 3 4 5 6 pH3 pH4 pH5 pH6 pH7
Hình 3.10:Ảnh hưởng của pH đến độ bền củapectinase từ A. nigerCF2
Kết quả cho thấy pectinase từ chủng A.niger CF2 bền trong vùng pH 4 – 5. Sau 6 giờ ủ ở 40oC trong đệm pH 4 - 5 hoạt độ enzyme vẫn còn giữ hơn 60% so với ban đầu [12] Ở pH 6, 7 hoạt độ enzyme không ổn định và giảm đáng kể sau 6 giờ.
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền enzyme
Nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF2
Mỗi enzyme đều có một giá trị nhiệt độ tối ưu mà ở đó hoạt tính của nó được thể hiện mạnh nhất cũng như có vùng nhiệt độ mà ở đó hoạt tính enzyme ít bị ảnh hưởng nhất gọi là vùng bền nhiệt của enzyme. Với mục đích xác định được nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF2, dịch enzyme được giữ ổn nhiệt tại các nhiệt độ 30 – 70oC.
30oC 40oC 50oC 60oC 70oC 0 1 2 3 4 5 6
Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ peptinase từ A. niger CF2
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của pectinase từ chủng A. niger CF2 thấy khi tăng nhiệt độ từ 30oC – 40oC, hoạt độ enzyme tăng và đạt cực đại tại 40oC. Khi nhiệt độ lớn hơn 40oC, hoạt độ enzyme giảm rất nhanh. Như vậy, nhiệt độ tối ưu của pectinase từ A. niger CF2 là 40oC, cao hơn so với nhiệt độ tối ưu (35oC) của peptinase từ Bacillus sp. MFW7[8], bằng nhiệt độ của pectinase từ A. niger sử dụng nguồn cacbon từ vỏ cam[9].
Độ bền nhiệt:
Dịch enzyme được giữ ổn nhiệt tại các nhiệt độ 30 – 70oC ở pH 4,5 trong khoảng thời gian 5h, cứ 1h tiến hành xác định hoạt độ enzyme và biểu diễn kết quả trên hình
0h 1h 2h 3h 4h 5h 0 1 2 3 4 5 6 30oC 40oC 50oC 60oC 70oC
Hình 3.12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền pectinase từ chủng A.niger CF2
Kết quả khảo sát cho thấy pectinase từ cả chủng A.niger CF2 là enzyme không bền nhiệt. Khi nhiệt độ tăng hoạt độ của pectinase giảm dần và enzyme chỉ bền ở 30 - 50ºC. Khi nhiệt độ lớn hơn 50oC hoạt độ của enzyme giảm rất nhanh và sau 5 giờ thì hoạt độ enzyme còn rất thấp.
3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính enzyme
Enzyme được ủ trong đệm có bổ sung ion kim loại nồng độ 10mM. Xác định hoạt độ và biểu diễn kết quả trên hình 3.13:
ĐC Ca2+ Fe2+ Mn2+