Công nghệ sinh học đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong thế kỷ 21, như vai trò của công nghệ tin học vào cuối thế kỷ vừa qua. Các công nghệ mới áp dụng trong các ngành sinh và y học sẽ dần thay thế các phương pháp cũ đang
được sử dụng trong bệnh viện và phòng thí nghiệm. Các màng sinh học được
định nghĩa là ranh giới của các tế bào, là điển hình cho vật liệu hữu cơ cấu trúc nano có trạng thái luôn biến đổi và phức tạp [57]. Chúng là sự lắp ghép của các siêu phân tử proteins, glycoproteins, và các oligosaccharides gắn vào hoặc nhúng vào trong một lớp lipid lỏng hoặc lớp vỏ protein. Các phần tự lắp ghép có thể có độ lớn trong khoảng một vài tới vài trăm nanomét.
Sự lắp ghép liên kết trên diện rộng trong các màng sinh học điều khiển rất nhiều quá trình trong thực thể sống (từ vi khuẩn tới các thực thể đa bào phức tạp). Tương tác giữa các cặp ligand-receptor đơn (hay thường là các nhóm hoặc cụm phân tử) cho phép tế bào có khả năng phản ứng với môi trường, tác động lên các tế bào khác, và điều chỉnh các chức năng nội bào như di trú, bám dính, phát triển, phân chia, phân ly và sự chết của tế bào.
Sự phức tạp về thành phần và sự thay đổi của các bề mặt sinh học làm cho việc nghiên cứu chi tiết các hệ sinh học trở nên rất khó khăn. Bề mặt mẫu có các thành phần cố định, là công cụ hữu ích để nghiên cứu các tính chất vật lý-hoá học hữu cơ của bộ nhận diện phân tử sinh học (ví dụ, nhiệt động và động lực học của sự tổ chức/phân ly của các proteins của các phân tử sinh học khác với ligands) để xác định hiệu quả các sự nhận biết riêng biệt trạng thái của các tế
bào và nghiên cứu các thành phần cấu trúc mà cho phép bề mặt ngăn chặn sự
hấp thụ proteins.
Phát triển các ứng dụng công nghệ sinh học, như nuôi cấy tế bào, xử lý mô, và biosensors, cũng có thểđạt được từ những hệđơn giản cho phép một hoặc vài loại tương tác giữa các thành phần trong dung dịch (tế bào, phân tử sinh học, analytes) với bề mặt các hệ đã được xử lý [58]. Thách thức đầu tiên trong phát triển các bề mặt mẫu này là tạo ra các phương thức cho phép điều khiển chính xác thành phần và cấu trúc của bề mặt trong khi vẫn cho phép các tương tác sinh
học tự nhiên xuất hiện để kết quả có thể giải thích rõ ràng và liên kết với sinh học in-vivo.
Một trong những kỹ thuật hàng đầu trong công nghệ sinh học phải kể đến là kỹ thuật biochip (chip sinh học). Nhiều chuyên gia cho rằng, chip sinh học sẽ
thay đổi toàn bộ các phương pháp nghiên cứu hiện nay, giúp giảm thời gian, tiết kiệm chi phí nghiên cứu và phát triển các loại thuốc mới.
Biochip gồm các vật liệu sinh học (DNA, RNA hoặc protein) gắn trên bề
mặt chip có đế là thủy tinh, nhựa, bán dẫn hoặc kim loại. Chúng đóng vai trò tiên phong trong việc phát hiện ra các DNA (lai tạo DNA trong việc chuẩn đoán các gen bệnh), các gen đột biến, số lượng các gen hỏng và trong việc tìm ra các tương tác kháng thể - kháng nguyên trong nhận dạng các vi sinh vật và vũ khí sinh học.
Hình 9. Sơđồ bề mặt hóa học của một chip sinh học BARC (Bead Array Counter) và thí nghiệm lai hóa.
Một bước quan trọng trong quá trình chế tạo biochip là tạo liên kết giữa các vật liệu sinh học với đế, trong đó công nghệ phổ biến là sử dụng bề mặt vàng làm đế, các cực sinh học thiol được giữ liên kết với bề mặt vàng qua liên kết Au- S (Hình 9). Để thực hiện điều này cần tạo một bề mặt trung gian có liên kết thiol
với bề mặt vàng và có các nhóm chức hữu cơ để có thể gắn vật liệu sinh học lên
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và vật liệu
Axít thioglycolic có công thức hoá học: HSCH2COOH (hình 10), còn có các tên gọi khác như: axít 2-mercaptoacetic, axít thiovanic, axít 2-thioglycolic , axít alpha-mercaptoacetic.
Hình 10. Công thức hóa học của axít thioglycolic.
“Thio” là tiền tố trong hoá học chỉ sự thay thế một nguyên tử oxy trong 1 gốc axít bởi một nguyên tử sulfur. Tên của chúng được đọc bằng cách thêm vào sau “thio” một hậu tố là tên của hợp chất ban đầu. Khi –SH không phải là nhóm
đặc trưng, tiền tố mercapto được đặt vào trước tên của hợp chất ban đầu để chỉ
nhóm –SH không bị thay thế. Với axít thioglycolic, cấu tạo là một nhóm sulfur
đơn giản được gắn đuôi axít carboxylic.
Axít thioglycolic là dung dịch trong suốt ở nhiệt độ phòng, tan chảy ở - 16oC, phân huỷ ở khoảng 78oC; rất dễ tan trong nước, cồn, axetôn; hoà tan ít trong các ethyl khác, ít bị hoà tan trong dung môi hydrocarbon; bị polymer hoá
ở trên 50oC.
Màng vàng dùng làm đế được chế tạo bằng phương pháp phún xạ trên đế
silic tại trường Đại học Pusan Hàn Quốc (PNU). Màng này có độ dày 200nm,
được kiểm tra trước khi tạo SAM bằng kính hiển vi quét đầu dò SEM, kính hiển vi lực nguyên tử AFM và phổ nhiễu xạ tia X.
Một số vật liệu khác cũng có các tính chất tương tự, nhưng SAM hình trên các vật liệu này được nghiên cứu ít hơn vàng. Bạc là đế dùng cho SAM của alkanethiol nhiều chỉ sau vàng, nhưng nó dễ bị oxy hóa trong không khí và độc hại với tế bào [59-61]. Tuy nhiên, nó có thể đem lại SAM chất lượng cao với một cấu trúc đơn giản hơn vàng (là kết quả của góc nghiêng nhỏ hơn). Đồng
cũng được quan tâm vì nó là vật liệu phổ biến để gắn kết các lớp trong lằng
đọng không điện, nhưng nó lại dễ bị oxy hóa hơn cả bạc [20].
Hình thành SAM trên đế được thao tác bằng tay trong điều kiện khí quyển của phòng thí nghiệm về cơ bản là một quá trình trao đổi: thiol phải thay thế các vật liệu ngoại lai bám trên bề mặt đế trước khi nhúng vào dung dịch thiol. Trạng thái này xảy ra do trên thực tế, thiol có khả năng thay thế các chất tạp bám vào từ trước. Sự thay thế với thiol đầu tiên yêu cầu sự tách ra của các chất tạp và các chất nhiễm bẩn; do đó tốc độ tách ra của các chất bẩn làm ảnh hưởng tới động học của sự hình thành SAM. SAM có những tính chất của vật liệu tự sinh sản khi hình thành trên đế nhúng trong dung dịch thiol trong thời gian chế tạo ~1h hoặc đã được làm sạch bằng phương pháp hóa học (dung dịch “piranha” – H2SO4:H2O2) hoặc plasma. Đặt vào điều kiện thường trong thời gian dài hơn dường như cho phép sự hút bám của vật liệu mà không dễ dàng thay thế trong thời gian cho phép hình thành SAM.
Định hướng mạng tinh thể của đế Au(111) là rất quan trọng và ảnh hướng trực tiếp tới việc hình thành SAM. Sự chọn lọc của quá trình hình thành SAM, do tính chất của các phản ứng hoá học bề mặt, xác định hướng của những phân tử bám vào này, và do đó nó ảnh hướng tới mức độ của trạng thái lắp ghép của các SAM hình thành. Trong trường hợp này, tương tác riêng giữa các nguyên tử
S của Thiol và nguyên tử Au theo lý thuyết SHAB (soft and hard, acids and base) và hình thành liên kết Au-S. Quá trình này là một phản ứng toả nhiệt theo chiều hấp thụ gần như là tối đa của phân tử thiol tới mức xếp chặt và do đó hình thành SAM. Thêm vào đó, lực liên kết Van der Waals của các đuôi phân tử cũng giúp tạo nên sự bám dính của các phân tử xếp chặt này.
2.2. Quy trình thực nghiệm tạo màng SAM
Hình 11. Quy trình thí nghiệm tạo màng SAM TGA trên bề mặt vàng.
Quy trình thí nghiệm tạo màng SAM thioglycolic trên bề mặt vàng được thể hiện trên hình 11, gồm các bước sau:
• Xử lý làm sạch màng vàng
Màng được ngâm trong dung dịch piranha trong 30 phút tại 80oC để
làm sạch các tạp chất trên bề mặt vàng.
Rung siêu âm trong axeton trong 20 phút.
Rung siêu âm trong ethanol trong 20 phút.
Sấy khô ở nhiệt độ 60oC, bảo quản sạch chuẩn bị cho các bước tiếp theo.
Màng vàng được phân tích cấu trúc và hình thái bằng kính hiển vi quét đầu dò SEM, hiển vi lực nguyên tử AFM và máy đo nhiễu xạ
tia X (XRD).
• Chuẩn bị dung dịch
Axít thioglycolic được bảo quản ở nhiệt độ phòng, tránh tiếp xúc với ánh sáng và hạn chế tiếp xúc với không khí.
Axít thioglycolic được pha trong dung môi ethanol với nồng độ
10mM. Dung dịch sau khi pha xong được đưa ngay vào thí nghiệm tạo màng SAM.
• Nhúng màng vàng đã được làm sạch ở trên vào dung dịch axít thioglycolic 10mM. Hệ dung dịch-mẫu được giữ trong điều kiện nhiệt độ
phòng, tránh tiếp xúc với ánh sáng và khí quyển.
• Sau 24h, lấy màng vàng ra khỏi dung dịch, rửa sạch các tạp chất và các thiol vãng lai trên bề mặt vàng bằng ethanol. Để khô tự nhiên và bảo quản sạch ở nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho các phương pháp phân tích.
2.3. Các phương pháp phân tích
Quy trình phân tích màng SAM thioglycolic trải qua các bước sau: 1. Bề mặt vàng trên đế Silic trước khi thực hiện tự lắp ghép phân tử được
phân tích hình thái bằng phương pháp kính hiển vi lực nguyên tử AFM và phân tích cấu trúc bằng phương pháp nhiễu xạ tia X. Bề mặt vàng phẳng đồng đều với định hướng (111) là tốt nhất cho quá trình tự lắp ghép phân tử [5, 12].
2. Sau khi thực hiện thí nghiệm tự lắp ghép phân tử, câu hỏi lớn nhất là liệu có sự hình thành màng SAM của axít thioglycolic trên bề mặt vàng với liên kết S-H chắc chắn giữ nhóm chức –COOH, tạo một bề mặt có thể biến tính bề mặt vàng như mong muốn. Chúng tôi đã thực hiện 2 phép đo phổ Raman và phổ hồng ngoại để kiểm chứng liên kết S-H và sự xuất hiện của các nhóm hữu cơ khác trên bề mặt vàng.
3. Sử dụng phương pháp xây dựng đường chuẩn trong trắc quang với thuốc thử là Xanh methylen trước và sau khi tương tác với bề mặt SAM, chứng minh sự tồn tại của nhóm chức –COOH trên bề mặt đế đồng thời tính toán được mật độ phân tử SAM trên đế vàng.
2.3.1. Phân tích chất lượng màng vàng 2.3.1.1. Hiển vi điện tử quét SEM
Kính hiển vi điện tử quét (SEM) là thiết bị quan sát bề mặt vật liệu với độ
phân giải cao bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu. Việc tạo ảnh của mẫu vật được thực hiện thông qua việc ghi nhận và phân tích các bức xạ điện tử thứ cấp phát sinh từ tương tác của chùm điện tử tới bề mặt mẫu vật.
Trong kính hiển vi điện tử quét, chùm điện tử tới được tạo ra từ súng phóng điện tử (có thể là phát xạ nhiệt, hay phát xạ trường, ...), sau đó được tăng tốc và hội tụ thành một chùm điện tử hẹp (cỡ vài trăm Angstrong đến vài nanomét) nhờ hệ thống thấu kính điện từ. Thế tăng tốc của SEM thường từ 10 kV đến 50 kV. Chùm điện tử hội tụ được quét trên bề mặt mẫu nhờ các cuộn quét tĩnh điện.
Độ phân giải của SEM được xác định từ kích thước chùm điện tử hội tụ, mà kích thước của chùm điện tử này bị hạn chế bởi quang sai, chính vì thế mà SEM không thể đạt được độ phân giải tốt như thiết bị hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Ngoài ra, độ phân giải của SEM còn phụ thuộc vào tương tác giữa vật liệu tại bề mặt mẫu vật và chùm điện tử tới. Khi điện tử tương tác với bề mặt mẫu vật, sẽ có các loại bức xạ phát sinh, sự tạo ảnh trong SEM và các phép phân tích thành phần vật liệu được thực hiện thông qua việc phân tích các bức xạ này.
Ảnh SEM thu được thông qua việc thu nhận cường độ tín hiệu điện tử thứ
cấp theo vị trí quét của chùm điện tử tới. Chùm điện tử thứ cấp có năng lượng thấp (thường nhỏ hơn 50 eV) được ghi nhận bằng ống nhân quang nhấp nháy. Vì chúng có năng lượng thấp nên chủ yếu là các điện tử phát ra từ bề mặt mẫu với
độ sâu chỉ vài nanômet, do vậy chúng tạo ra ảnh hai chiều của bề mặt mẫu. Như
vậy, chụp ảnh SEM là một trong những phương pháp rất hữu hiệu để nghiên cứu bề mặt của mẫu.
2.3.1.2. Hiển vi lực nguyên tử AFM
Hình 12. Sơ đồ nguyên lí của kính hiển vi lực nguyên tử.
Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM - Atomic Force Microscope) là một dụng cụ tuyệt vời để khảo sát cấu trúc bề mặt của cả các vật liệu dẫn điện và cách điện. Thiết bị này hoạt động trên nguyên lý sử dụng một đầu dò (thường làm bằng kinh cương) có kích cỡ ở đầu là một nguyên tử được rung và quét qua bề mặt của vật liệu, dựa vào việc ghi nhận lực tương tác giữa đầu dò này với các nguyên tử bề mặt, qua đó có thể xây dựng lại ảnh bề mặt lồi lõm của vật liệu, từ
các hình thái học cho đến ảnh 3 chiều của bề mặt. 2.3.1.3. Nhiễu xạ tia X
Nhiễu xạ tia X (XRD, X-Ray Diffraction) X dùng để phân tích cấu trúc tinh thể rất nhanh chóng và chính xác, ứng dụng nhiều trong việc phân tích các mẫu chất, sử dụng trong nghiên cứu, trong công nghiệp vật liệu, trong ngành vật lí, hóa học và trong các lĩnh vực khác.
Nguyên lý chung của phương pháp nhiễu xạ tia X xác định kích thước tinh thể là dựa vào ảnh hưởng khác nhau của kích thước tinh thể lên phổ nhiễu xạ.
Hình 13. Sơđồ nguyên lý hoạt động của thiết bị nhiễu xạ tia X.
Theo nguyên lý cấu tạo tinh thể, mạng tinh thể nguyên tử hay ion phân bố đều đặn trong không gian theo một qui luật nhất định, khoảng cách giữa các nút mạng vào khoảng vài Å tức là xấp xỉ với bước sóng tia Rơnghen (tia X). Do đó khi chiếu chùm tia X tới bề mặt tinh thể và đi sâu vào bên trong mạng lưới tinh thể thì mạng tinh thể này đóng vai trò như một cách tử nhiễu xạ đặc biệt. Các nguyên tử, ion bị kích thích bởi chùm tia X sẽ thành các tâm phát xạ ra các tia phản xạ.
Với một mạng tinh thể có khoảng cách d giữa các mặt tinh thể là cố định và chùm tia X có bước sóng không đổi, sẽ tồn tại nhiều giá trị góc θ thỏa mãn
định luật Bragg. Kết quả là trên bức tranh nhiễu xạ sẽ quan sát thấy có sự xuất hiện của các điểm sáng và trên phổ nhiễu xạ ta sẽ quan sát thấy sự xuất hiện của nhiều đỉnh nhiễu xạ (peaks) tại các góc θ khác nhau. Vị trí của các đỉnh nhiễu xạ
phụ thuộc vào bước sóng của tia X và cấu trúc tinh thể. Tính chất tinh thể được xác định từ vị trí và cường độ của đỉnh nhiễu xạ.
2.3.2. Xác định sự tồn tại của nhóm chức và liên kết Au-S 2.3.2.1. Phổ tán xạ Raman
Hiện tượng tán xạ không đàn hồi của ánh sáng năng lượng E0 (hυ0) khi đi qua một môi trường vật chất gọi là tán xạ Raman. Quá trình này sẽ sinh ra các photon với năng lượng bằng hiệu hoặc tổng năng lượng của các tia ánh sáng kích thích ban đầu với năng lượng dao động:
Khi kích thích, phân tử sẽ hấp thụ năng lượng và chuyển thành dao động cưỡng bức với tần số υ0, hυs là phần năng lượng mà photon ánh sáng thu vào hoặc mất mát do kích thích hoặc dập tắt một dao động phân tử hoặc điện tử môi trường.
Vạch tán xạ có năng lượng ERaman = hυv = hυ0 – hυs nhỏ hơn năng lượng của ánh sáng kích thích ban đầu, ứng với tần số υv: gọi là vạch Stocke. Những vạch có tần sốυvứng với năng lượng ERaman = hυv = hυ0 + hυs lớn hơn năng lượng