2. Xác định một số đặc điểm phân bố virút Hanta qua giám sát huyết thanh chuột tại một số tỉnh miền Bắc, Việt Nam 2001 – 2004 bằng kỹ thuật hấp phụ
4.1.1. Kết quả nghiên cứu trên huyết thanh bệnh nhân tại các điểm nghiên cứu 2001 – 2004 bằng kỹ thuật ELISA, kỹ thuật IFA, kỹ thuật WB
2001 – 2004 bằng kỹ thuật ELISA, kỹ thuật IFA, kỹ thuật WB
Do triệu chứng bệnh sốt nhiễm virút Hanta gần giống với sốt xuất huyết Dengue, sốt
mò do căn nguyên Ricketsiae hay sốt do Leptospirosis. Tiến hành xét nghiệm tìm
kháng thể IgG kháng virút Hanta tại các tỉnh trên, chúng tôi đã tìm thấy với kỹ thuật miễn dịch gắn men ELISA là 8,2% trong Bảng 3.2. tỷ lệ huyết thanh bệnh nhân có kháng thể IgG kháng virút Hanta ở huyết thanh bệnh nhân của các tỉnh/ thành phố
Hoà Bình, Hà Nội, Hà Nam và Thanh Hóa có ý nghĩa thống kê với P<0,05. Bằng kỹ
thuật IFA chúng tôi đã phát hiện tới 3,1% số mẫu dương tính, từ các bệnh nhân có kết quả dương tính với kỹ thuật ELISA tuy nhiên không có sự khác biệt với P >0,05 Bảng 3.3. Kỹ thuật IFA cho thấy hình ảnh huỳnh quang sáng và rõ. Với kỹ thuật WB
ở Bảng 3.4. chúng tôi đã tìm thấy 1,9% bệnh nhân dương tính với cả ba kỹ thuật trên và có ý nghĩa thống kê khi dùng kỹ thuật với P<0,05. Trong hai năm 1994 và 1995 thu thập mẫu bệnh phẩm là 5330 bệnh nhân có triệu chứng sốt cao đột ngột tại Hàn Quốc, các nhà nghiên cứu tại Đại Học Hàn Quốc bằng kỹ thuật IFA cũng đã phát
hiện ra 12,2% bệnh nhân có kháng thể IgG kháng virút Hanta. Kariwa H và cộng sự
đã điều tra trên 105 bệnh nhân thu thập tại thành phố Tokyo - Nhật Bản, có triệu
chứng mang bệnh gan hoàn toàn âm tính với virút viêm gan A,B,C với phương pháp
ELISA, IFA và WB đã tìm thấy 3 bệnh nhân (2,95%) có kháng thể kháng virút Hanta
bằng cả 3 phương pháp trên.
Trong giai đoạn tháng 5/1999 đến tháng 11/2000, bằng kỹ thuật ELISA với 115 bệnh nhân sốt không rõ nguyên nhân đã phát hiện ra 5 bệnh nhân có kháng thể IgG và 8 bệnh nhân có kháng thể IgM, nhưng chỉ có 1 bệnh nhân duy nhất là có kháng thể IgM và IgG Bệnh nhân đầu tiên của Thái Lan được phát hiện vào năm 2000, cũng là bệnh
nhân đầu tiên trong vùng Đông Nam Á được ghi vào Y Văn Thế Giới, năm 2004
chúng tôi đã tìm thấy một bệnh nhân tại tỉnh Hải Dương cũng trong năm 2005 chúng tôi đã phát hiện một vài bệnh nhân tại tỉnh Thanh Hóa, các bệnh nhân này đều có kháng thể IgG và IgM với tỷ lệ dương tính cao, gợi ý rằng đã có vụ dịch xảy ra [Số
Hanta tại tỉnh Thanh Hóa trong giai đoạn 2001-2004. Nghiên cứu năm 2000 tại Đài Loan ở tỉnh Kimen trên 85 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm bệnh Scrub typhus-sốt mò nhưng kết quả huyết thanh học âm tính, bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể
IgG đã tìm thấy 7 bệnh nhân chiếm tỷ lệ 8,23%. Với kỹ thuật IFA đã phát hiện dương tính ở cả 7 bệnh nhân trên. Pacsa AS và nhóm nghiên cứu đã điều tra trên nhóm bệnh nhân nghi ngờ là nhiễm bệnh sốt virút Dengue, sốt virút do ruồi Sandyfly và virút Hanta kết quả bằng kỹ thuật IFA phát hiện kháng thể IgG cho thấy có tới 11% trong số 46 bệnh nhân nguy cơ cao có kháng thể kháng virút Hanta như vậy tại Cô Oét đã có sự truyền bệnh do virút Hanta, gợi ý này có thể xảy ra cho nhóm huyết thanh bệnh nhân nghi nhiễm virút Hanta tại miền Bắc Việt Nam 2001-2004.
4.1.2. Kết quả nghiên cứu trên huyết thanh người lành tại các điểm nghiên cứu 2001 – 2004 bằng kỹ thuật ELISA, kỹ thuật IFA, kỹ thuật WB 2001 – 2004 bằng kỹ thuật ELISA, kỹ thuật IFA, kỹ thuật WB
Bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể IgG kháng virút Hanta, chúng tôi đã tìm thấy ở người lành có tỷ lệ như sau 8,4% tại Hà Nội; 7,8% tại Hà Nam; 8,9% tại Lào Cai; Hòa Bình là 7,2%; Thanh Hóa là 9,9%; tính tỷ lệ người lành dương tính ở các tỉnh thấy, tại các điểm nghiên cứu ở miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2001 – 2004, tỷ lệ
có kháng thể kháng virút Hanta trên người lành là 8,6% (99/1151) Bảng 3.5. kết quả
này khi so sánh với một vài nước ở châu Âu không khác biệt nhiều như là 6% ở Phần Lan, 8% ở Thụy Điển. Ngay tại Thái Lan qua giám sát huyết thanh học trên người lành thấy theo vùng địa lý khác nhau, môi trường khác nhau mà tỷ lệ người có kháng thể kháng virút Hanta cũng thay đổi từ 1,2% đến 31,4% bằng kỹ thuật ELISA. Ở Thái Lan với kỹ thuật IFA các nhà khoa học cũng đã tìm thấy 33% dân số sống khu nhà ổ
chuột, có kháng thể kháng virút Hanta. Với các mẫu dương tính kỹ thuật IFA, chúng tôi tiến hành kỹ thuật WB để khẳng định có lưu hành virút Hanta trong cộng đồng các tỉnh điều tra không? Kết quả cho thấy có sự lưu hành virút Hanta trên người lành với tỷ lệ trung bình 1,3% nhìn ở Bảng 3.7. thấy tất cả các tỉnh nghiên cứu đều có người lành có kháng thể IgG kháng virút Hanta.Với tỷ lệ cao nhất là tại Thanh Hóa, Hà Nội, Hà Nam và thấp nhất là ở Hòa Bình và số người có kháng thể IgG là 15 người trên 1151 người lành. Kết quả ELISA người lành chúng tôi nhận thấy có sự thay đổi tỷ lệ
giữa các tỉnh, nhưng sự khác nhau không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 Bảng 3.5.
4.1.3. Đánh gía xét nghiệm huyết thanh người qua ba kỹ thuật ELISA, IFA, WB tại các điểm nghiên cứu trong thời gian 2001-2004 tại các điểm nghiên cứu trong thời gian 2001-2004
Điều tra 1799 mẫu huyết thanh bệnh nhân và huyết thanh người lành tại 5 điểm nghiên cứu với kỹ thuật ELISA cho tỷ lệ 8,4% với P<0,05; Tiếp đến là kỹ thuật IFA cho tỷ lệ 3,6% với P>0,05; kỹ thuật WB giúp khẳng định sự tồn lưu virút Hanta phát hiện là 1,5% với P> 0,05. Theo Jiro Arikawa khi điều tra tình hình nhiễm virút Hanta
trên cộng đồng nhất thiết phải dùng kỹ thuật ELISA, kỹ thuật IFA, kỹ thuật WB, các kỹ thuật này có tính chất bổ xung cho nhau, giúp khẳng định sự lưu hành virút Hanta tại các điểm nghiên cứu. Kỹ thuật ELISA và kỹ thuật IFA để sàng lọc kháng thể IgG từ huyết thanh, với kỹ thuật ELISA có thể sàng lọc nhiều mẫu bệnh phẩm cùng một lúc và làm giảm thời gian hơn so làm bằng kỹ thuật IFA. Hai kỹ thuật ELISA và IFA có độ nhạy cao dễ sử dụng ở các phòng thí nghiệm hiện nay. Kỹ thuật WB mang tính
đặc hiệu và có độ nhạy cao, kết quả thấy băng khối luợng phân tử kDa. Trao đổi trực
tiếp với Richard Yanagihara tại Đại Học Hawaii (Tháng 7 năm 2005) và Jin Woo
Song tại Đại Học Korea (Tháng 1 năm 2006), hai nhà khoa học đều đồng ý với việc dùng kỹ thuật ELISA, IFA, WB cho chẩn đoán huyết thanh học bệnh do nhiễm virút Hanta, và khuyến cáo dùng kỹ thuật WB cho khẳng định các chẩn đoán huyết thanh học. Kỹ thuật ELISA luôn nhạy hơn so kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu hay kỹ
thuật kết hợp bổ thể và phù hợp khi xét nghiệm số lượng huyết thanh lớn. Kỹ thuật IFA yêu cầu bắt buộc khi chuẩn bị kháng nguyên đòi phải làm tại phòng an toàn sinh học BSL3, và không phù hợp khi làm với số lượng huyết thanh lớn. Yoshimatsu đã nghiên cứu thấy kỹ thuật WB nhạy hơn so với kỹ thuật IFA tới 10 lần khi phát hiện kháng thể IgG, khi pha loãng huyết thanh xét nghiệm ở tỷ lệ 1:10 sẽ không quan sát thấy nền như trong kỹ thuật ELISA và IFA sau khi nhuộm. Khi thực hiện các kỹ thuật chúng tôi đều pha loãng huyết thanh ở tỉ lệ 1:200 và nhận thấy chỉ số OD ở màng nền kỹ thuật ELISA thấp khi đọc kết quả bằng máy, qua kỹ thuật IFA gần như không có màng nền quan sát dưói kính hiển vi huỳnh quang, đến kỹ thuật WB đọc kết quả thấy
băng đặc trưng 51 kDa không có màng nền. Kháng nguyên nucleocapsid protein NP
tái tổ hợp bền và khi chuyển qua màng PDVF vẫn ổn định. Chính vì vậy khi xét nghiệm huyết thanh dùng kỹ thuật IFA và kỹ thuật ELISA sau đó kiểm tra lại bằng kỹ
thuật WB rất đặc hiệu trong chẩn đoán huyết thanh học. Kỹ thuật WB có khả năng phát hiện IgM sau 3 ngày nhiễm bệnh, trong khi kỹ thuật IFA chỉ phát hiện sau 5 ngày nhiễm bệnh, khuyến cáo dùng kỹ thuật WB cho khẳng định nhiễm hay không nhiễm virút Hanta. Giải thích cho sự khác nhau giữa ba loại phản ứng huyết thanh học như sau: kỹ thuật ELISA dùng kháng nguyên tái tổ hợp do vậy có thể phát hiện
các loại virút Hanta trong khi IFA và WB dùng kháng nguyên Hanta HTN 76-118
hay kháng nguyên virút Seoul nên chỉ phát hiện họ Hanta cụ thể virút Seoul.
Tại Paragoay trong một điều tra trên cộng đồng đã phát hiện tới 40% người lành có kháng thể IgG nhưng điều tra dịch tễ học không có mối liên quan với Hội chứng viêm phổi do virút Hanta (HPS) điều này có thể lý giải như sau: Thứ nhất trong cộng đồng có sự nhiễm nhiều týp virút Hanta và ít nhất một týp virút trong số đó gây nên bệnh sinh không đáng kể. Thứ hai có thể nhiễm một týp virút Hanta khác và biểu hiện bệnh
sinh nhẹ hơn virút Sin Nombre. Điều này cũng lý giải cho tình hình huyết thanh người lành dương tính có kháng thể IgG kháng virút Hanta tại các điểm nghiên cứu giai đoạn 2001-2004.
4.1.4. Mối liên quan giữa lứa tuổi và giới tính với sự đáp ứng kháng thể IgG kháng virút Hanta tại các địa điểm nghiên cứu giai đoạn 2001-2004 kháng virút Hanta tại các địa điểm nghiên cứu giai đoạn 2001-2004
Tại Hình 3.2. chúng tôi nhận thấy kháng thể IgG kháng virút Hanta tập trung ở lứa tuổi lao động độ tuổi là 21-25 đến 40-45, có 119 huyết thanh trên tổng số 1799 mẫu
huyết thanh nghiên cứu. Người mang kháng thể IgG kháng virút Hanta chiếm đa
phần là nam giới tại các điểm nghiên cứu, và tỷ lệ nam giới/ nữ giới ứng với 5:1. Nghiên cứu tại khu vực phía Nam, tác giảĐỗ Quang Hà nhận xét lứa tuổi có nhiễm virút Hanta tập trung độ tuổi 20-50. Tại Đài Loan các nhà khoa học đã phát hiện 7 bệnh nhân nhiễm virút Hanta, đều là nam giới và có độ tuổi từ 20 đến 28, cả 7 bệnh nhân này đều tham gia quân đội và đóng quân tại tỉnh Kinmen. Tại Thụy Điển các nhà khoa học nhận thấy tình hình nhiễm virút Hanta ở độ tuổi lao động chiếm ưu thế, số người có kháng thể cao ở nhóm công nhân lâm nghiệp và người làm nông do hay phải làm việc ở môi trường thiên nhiên nên khả năng tiếp xúc với chất thải ra từ
chuột nhiều, tỷ lệ kháng thể IgG kháng virút Hanta ở nhóm người sống tại nông thôn cao hơn nhóm người sống ở thành thị hiện tượng này lý giải do sống ở thành phố
sạch sẽ hơn nên người ít tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với các chất thải của chuột.
Điều tra huyết thanh học tại Hàn Quốc trong năm 1994 và 1995 thấy đa phần bệnh nhân là đàn ông và đều ở lứa tuổi lao động. Ngay tại Vương Quốc Anh trong thời gian 1985 – 1989 bệnh nhân nhiễm virút Hanta đa phần đàn ông.
4.2. Xác định một số đặc điểm phân bố virút Hanta qua giám sát huyết thanh chuột tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam 2001-2004 bằng kỹ thuật hấp phụ miễn chuột tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam 2001-2004 bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA), kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA), kỹ thuật Western Blot (WB)
4.2.1. Kết quả nghiên cứu trên huyết thanh chuột tại các điểm nghiên cứu 2001-2004 bằng kỹ thuật ELISA, kỹ thuật IFA, kỹ thuật WB 2004 bằng kỹ thuật ELISA, kỹ thuật IFA, kỹ thuật WB
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã bắt được tổng số 258 chuột gồm 180 chuột R. novergicus, 39 chuột R. flavipectus, 39 chuột S. murimus tại các tỉnh Hà Nội, Hà
Nam, Lào Cai, Hòa Bình và Thanh Hóa Bảng 3.8.và trong các nhóm chuột đều có
chuột đực và chuột cái. Với kỹ thuật ELISA chúng tôi đã tìm thấy kháng thể IgG có trên chuột R. novergicus với tỷ lệ cao nhất là Hà Nam 17,2%; Thanh Hóa 3,3%; Lào
Cai 2,2%; Hòa Bình 1,6% và cuối cùng là Hà Nội 1,1%. Theo Thắng và cộng sựđã
tìm thấy tỷ lệ kháng thể kháng IgG trên chuột R. novergicus tại Hà Nam là 53,4%, tại Thanh Hóa là 14,75% trong năm 2003. Tỷ lệ dương tính thấy chiếm đa phần ở chuột
đực R. novergicus tại các tỉnh Hình 3.4.Với kỹ thuật IFA và kỹ thuật WB chúng tôi cũng đã phát hiện ra virút Seoul trên chuột R. novergicus tại hai tỉnh Hà Nam và Thanh Hóa Bảng 3.9. Tại Indonesia các nhà khoa học cũng đã tìm thấy virút Hanta trên cả chuột R. novergicus với tỷ lệ 10,8% -24/238 chuột. Nhóm nghiên cứu Wong TW dùng kỹ thuật IFA đã tìm thấy 32% - 36/113 chuột R. novergicus có kháng thể
IgG. Kết quả IFA của chúng tôi thấy tại các điểm nghiên cứu là 20/180 chuột R. novergicus Bảng 3.12. Nghiên cứu chúng tôi không phát hiện thấy kháng thể IgG kháng virút Hanta trên chuột R. flavipectus, S. murinus tại các điểm nghiên cứu 2001 – 2004. Điều tra huyết thanh học trên chuột tại Cam Pu Chia, thấy kháng thể kháng IgG trên chuột phân bố như sau R. rattus chiếm 6,3%, R. novergicus chiếm 20,9%, không thấy có kháng thể IgG trên chuột R. exulans. Những nghiên cứu đầu tiên tại Thái Lan năm 1998 cho thấy tỷ lệ kháng thể kháng IgG trên chuột là 13,3% trong đó chuột Bandicota savilei 35,7%và R. norvegicus 31,5%.
4.2.2. Nhận xét về tình hình huyết thanh chuột tại các điểm nghiên cứu 2001 -2004 2004
Theo TCYTTG khuyến cáo dùng kỹ thuật ELISA để điều tra kháng thể IgG trên
chuột trong các điều tra dịch tễ. Tuy nhiên kỹ thuật IFA được gợi ý trong xét nghiệm huyết thanh chuột, và cần thiết dùng kỹ thuật WB để khẳng định. Tìm thấy kháng thể
IgG kháng virút Hanta trên chuột có ý nghĩa quan trọng khi nghiên cứu về ổ chứa virút Hanta và nghiên cứu về sinh thái virút. Các nhà khoa học cũng đã tìm thấy tỷ lệ
nhiễm virút Hanta trên chuột đực R. novergicus luôn luôn cao hơn so với chuột cái với lập luận do bản tính sinh học, do đấu tranh sinh tồn chuột đực thường hay đánh lộn cắn lẫn nhau hơn so chuột cái, do vậy khi chuột đực bị thương là một nguyên nhân để lan truyền virút Hanta trong cộng đồng chuột. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thấy chuột có kháng thể kháng virút Hanta ở kỹ thuật ELISA, IFA và WB đều là chuột đực Hình 3.4. Con đường lây truyền virút Hanta từ chuột sang người thông qua hít vào các chất bài tiết thải ra từ chuột. Nghiên cứu tại Trung và Tây Phi chưa phát hiện thấy bệnh nhân nhiễm virút Hanta nhưng phát hiện thấy sức cảm thụ ở người rất dễ bị nhiễm virút họ Hanta. Hiện tại có độ 30 týp virút Hanta, mỗi týp Hanta lại cư
ngụ trên mỗi loài chuột khác nhau. Mỗi loài chuột này sống tại các vùng địa lý khác nhau, sinh hoạt khác nhau, thức ăn khác nhau. Arikawa Jiro và cộng sựđã khẳng định
ở đâu chuột có kháng thể kháng virút Hanta thì cùng khu vực đó phải có người mang kháng thể IgG kháng virút Hanta và có thể có cả bệnh nhân cấp tính do nhiễm virút Hanta. Chuột có thể dịch chuyển thông qua các tỉnh bằng các phương tiện giao thông như xe tải, xe khách, tàu hòa, giống như đã có sự xâm nhiễm virút Seoul trên chuột bẫy tại thành phố Bắc Kinh có nguồn gốc từ nơi khác chuyển đến. Với các gợi ý trên,
cùng kết quả nghiên cứu trên chuột R. novergicus chúng tôi mô phỏng cách truyền bệnh virút Hanta từ chuột sang người như sau:
Hình 4.1. Sơđồ truyền nhiễm virút Hanta từ chuột sang người.
4.2.3. Kết quả bước đầu phát hiện virút Seoul trên chuột tại Hà Nội
Hình 3.5 cho thấy kết quả RT-PCR, tiếp đến phân tích trình tự gien M trên chuột R.