- Định tính một số nhóm hợp chất chính có trong nước sắc bài thuốc: Dùng các phản ứng định tính vói các thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng
2.2.2.2.Thử hoat tính chốnư oxv hoá in vitro của bài thuốc:
*Xây dựng đường chuẩn:
-Từ MDA tinh khiết, pha các dung dịch MDA có nồng độ chuẩn khác nhau. Cho vào mỗi ống nghiệm đã đánh số 1 ml dung dịch MDA chuẩn, thêm 0,5 ml acid thiobarbituric, lắc đều, đun cách thuỷ 30 phút.
- Để nguội ở nhiệt độ phòng, đo độ hấp thụ quang của các ống. - Lập đường chuẩn.
Đường chuẩn hàm lượng MDÂ
*Tiến hành định lượng MDA trong dịch đồng thể gan chuột nhắt trắng;
- Bước 1: Nước sắc 1:1 của bài thuốc được pha loãng 100 lần, được dung dịch có nồng độ 10 mg dl/ml.
- Bước 2- Chuẩn bị dung dịch treo đồng thể gan chuột: cân chính xác khoảng 0,4 gam gan chuột, cho vào cối chày thuỷ tinh chứa 5 ml KCl 0,016M nghiền trên đá tan 4"c, thời gian nghiền 3 phút/mẫu thu được một hỗn dịch đồng đều.
- Bước 3-Xúc tác phản ứng ôxy hoá in viưo bằng acid ascorbic và sắt (II) sulphat.
Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6
Dung dịch thừ 0,0 ml 0,1 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,4 ml 0,5 ml
Hỗn dịch đổng thể gan chuột 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Dung dịch KCl 0,Q16M 0,5 ml 0,4 ml 0,3 ml 0,2 ml 0,1 ml 0,0 ml Dung djch muối Mohr 4,2.10' M 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml Dung dịch acid ascorbic 2,5.10 M 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1ml
Lác đều các ống, ủ ỏ nhiệt độ 37^c trong binh điều nhiệt 20 phút.
- Bước 4: Thêm 0,5 ml acid tricloracetic vào mỗi ống nghiệm ưên, lắc đều, li tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút.
- Bước 5: Lấy 1 ml dung dịch trong ở mỗi ống cho vào các ống nghiệm có đánh số tương ứng. Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml acid thiobarbituric 0,4%, lắc đều. Đun sôi cách thủy 30 phút rồi để nguội đến nhiệt độ phòng.
- Bước 6: Đo độ hấp thụ quang của phức tạo thành giữa MDA và acid thiobarbituric ỏ bước sóng 532 nm, từ đồ thị chuẩn tính được hàm lượng MDA.
Kết quả đo hàm lượng MDA được ghi ở bảng 2.8 và biểu đồ 2.1. Bảng2.8: Khả năng ức chế in vitro phản ứng POL của nước sắc bài thuốc Nước sắc bài thuốc đã pha loãng Mật độ quang E Hàm lượng
MDẤ (nmol) Độ ức chế so với đối chứng Thể tích (ml) Nồng đô (mgdược ỉiộu/ml) 0,0 ' 0,00 0,400 l ỉ,20 0% 0,1 0,35 0,190 5,55 50,5% 0,2 0,70 0,167 4,70 58,0% 0,3 1,05 0,090 2,50 77,7% 0,4 1,40 0,082 2,25 79,9% 0,5 1,75 0,07 1,95 82,6%
□ ŨOiĩỊgtrl SQ35rngW □ Ũ7rrghl ■ 1.05 rngM ■ L4)nig/tii 1 1.75nỊghi
Nổng đậ dkng cỊdi ttiir(n:)g dbọcliệiyiTỈ)
Hình 2.8: Thí nghiệm đo hoạt tính chống oxy hóa của bài thuốc.
Nhận xét: Qua kết quả trên, có thể thấy rằng nước sắc của bài thuốc đều ức chế phản ứng POL ở các mức độ khác nhau và tỉ lệ thuận so vód nồng độ thuốc. Từ nồng độ 0,35 đến 1,75 mg dược liệu/lm l dung dịch thử, độ ức chế phản ứng POL tăng từ 50,5% đến 82,6%. Thí nghiêm ừên đã chứng tỏ nước sắc bài thuốc có tác dụng chống oxy hóa rõ rệt.