- Định tính một số nhóm hợp chất chính có trong nước sắc bài thuốc: Dùng các phản ứng định tính vói các thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng
22.1 5 Đinh tính Coumarin:
C h iết x u ấ t: Cho 20 ml N Sl vào bình gạn, chiết bằng Cloroform 3 lẫn, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết Cloroform, lắc kỹ với 20 ml NaOH 10%, gạn lấy lớp NaOH. Acid hoá dịch chiết bằng HCl đặc, sau đó lắc với Cloroform 3 lần mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết Cloroform, M ột phần cố đặc để chấm sắc ký, phần còn lại cất thu hổi dung môi, hoà tan cắn vào 5 ml cồn 90" để làm các phản ứng định tính:
- Phản ứng dựa vâo độ tan khi đóng mở vỏng lacton: chuẩn bị 2 ống nghiệm: + Ống 1: cho vào 1 ml địch chiết và 0,5 ml NaOH 10%.
+ Ống 2: cho vào 1 ml dịch chiết.
Đun cách thuỷ cả 2 ống trong 5 phút, thêm vào mỗi ống 4 ml nước cất thấy Ống 1 trong, ống 2 đục. Acid hóa ống 1 thì ống 1 trở iại đục như ống 2. Phản ứng
dưofng tính.
- Phản ứng dựa vào huỳnh quang tăng lên ở môi trường kiềm: nhỏ 3 giọt dịch chiết lên tò giấy lọc, nhỏ tiếp 3 giọt NaOH 5%, sấy nhẹ cho khô. Che một nửa diện tích dịch chiết bằng một mẩu kim loại rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút, bỏ miếng kim loại ra. Quan sát dưới đèn tử ngoại, thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che, tiếp tục chiếu sáng thấy phần bị che sáng đần lên bằng phần không bị che. Phản ứng dưcmg tính.
- Phản ứng Diazo hóa: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội, nhỏ vài giọt thuốc thử Diazo, thấy xuất hiện màu đỏ gạch. Phản ứng dương tính.
Qua các phản ứng định tính, sơ bộ kết luận trong nước sắc của bài thuốc có Coumarin.
2.2.Ỉ.L 6. Đinh tính ỉridoid:
C hiết xuất: Lấy 20 ml N S l, loại tạp bằng ether dầu hoả. Lắc dịch chiết nước với n-butanol 3 lần, mỗi lần 10 ml, gộp các địch chiết n-butanol, cất thu hồi dung môi, hoà tan một phần cắn thu được vào 1 ml Metanol để chấm sắc ký, phần còn lại hoà tan vào 5 ml cồn 50'* để làm phản ứng định tính.
Phẩn ứng Trim-Hỉll: cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiêm, thêm 0,5 ml thuốc thử Trim-Hill, đun nhẹ, thấy xuất hiện màu tím đỏ. Phản ứng dương tính. Sơ bộ kết luận trong nước sắc của bài thuốc có Iridoid.
Thuốc thử Trim-Hill: 10 ml acid acetic + 1 ml CUSO4 0,2% + 0,5 ml H2SO4 đặc. 2.2.7.7.7. Đinh tính Curcumin:
C hiết x u ất; Cho 20 ml NSl vào bình gạn, lắc với Cloroform 3 lần mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết Cloroform, một phần cô đặc để chấm sác ký, phần còn lại cất thu hồi dung môi, hòa tan cắn vào 5 ml cồn 90’’ để làm các phản ứng định tính :
- Phản ứng với dung dịch NaOH 10%: cho Im l dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 10 ml NaOH 10% vào lác đều, thấy dung dịch xuất hiện màu đỏ tươi. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng với H ß Ö4 đặc: cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt H2SO4 đặc lắc đều, dung dịch xuất hiện màu đỏ sẫm. Phản ứng dương tính.
- Phản ứng với dung dịch acid boric 5%: cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiêm, thêm 0,5 ml dung dịch a d d boric 5%, xuất hiện màu vàng cam rồi chuyển sang nâu. Phản ứng dưcỉng tính.
- Phản ứng với dung dịch acid oxalic 10%: cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml đung dịch acid oxalic 10%, lắc đều, dung dịch xuất hiện màu vàng cam đậm. Phản ứng dưoíng tính.
Qua các phản ứng định tính, sơ bộ kết luận trong nước sắc của bài thuốc có Curcumin.
2.2.1.ỉ . 8. Đinh tính chất héo:
Lấy 20 ml NSl cho vào bình gạn, lắc với ether ethylic 3 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp các dịch chiết ether, để bay hơi còn 5ml. Nhỏ 3 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, để khô quan sát thấy có một vết mờ ưên giấy. Như vậy trong nước sắc của bài thuốc có chất béo.
2.2.1.ỉ . 9. Đình tính cắc acid hữu cơ:
Lấy 5 ml NSl cho vào ống nghiệm to, thêm vào một ít bột Na2C0 3, lắc nhẹ, thấy có bọt khí xuất hiện. Sơ bộ kết luận trong nước sắc của bài thuốc có các acid
hữu cơ.
2.2.Ỉ.Ĩ.Ỉ0. Đinh tính a c id amin:
Lấy 20 ml N S l, loại tạp bằng ether dầu hoả, thêm đổng lượng aceton, lắc đều, để tủ lạnh 3 giờ, lọc lấy dịch lọc, loại màu bằng than hoạt, cô địch lọc còn 5 ml để
làm phản ứng định tính: 2 ml dịch lọc thêm 3 giọt thuốc thử Ninhydrin, đun cách thuỷ 2-3 phút, xuất hiện màu tím sẫm. Sơ bộ kết luận trong nước sắc của bài thuốc có acid amin ở dạng tự do.
Kết quả định tính các nhóm hợp chất của nước sắc bài thuốc được tóm tắt ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá học của bài thuốc.
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Sơ bộ kết luận
1 Flavonoid -Phản ứng Cyanidin -Phản ứng với kiềm -Phản ứng với FeCl3 -Phản ứng Diazo hoá +++ ++ +++ ++ Có Flavonoid 2 Alcaloid -Thuốc thử Mayer -Thuốc thử Dragendoff -Thuốc thử Bouchardat ++ +++ ++ Có Alcaloid 3 Saponin
-Hiện tượng tạo bọt -Phản ứng Rosenthaler -Phản ứng Liberiĩian-Bouchard -Phản ứng Salkowski +++ + Không có Saponosid 4 Glycosid tim -Phản ứng Liberman -Phản ứng Baljet -Phản ứng Legal -Phản ứng Keller-Kiliani - Không có Glycosid tim 5 Coumarin -Đóng mở vòng iacton
-Huỳnh quang tăng lên ở môi trường kiềm -Phản ứng DÌazo hóa
++ ++ ++
Có Coumarin
6 Iridoid -Phản ứng Trim-Hill + Có Iridoid
7 Curcumin
-Phản ứng vổi dung dịch NaOH 10% -Phản ứng với H2SO4 đặc
-Phản ứng với dung dịch acid boric 5% -Phản ứng với dung dịch acid oxalic 10%
+++ ++
++
++ Có Curcumin
8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc ++ Có chất béo
9 Acid hữu cơ Phản ứng với Na^co, ++ Có acid hữu cơ
10 Acid amin Thuốc thử Ninhydrin ++ Có acid amin
Ghi chú (-): Phản ứng âm tính. (+): Phản ứng dưcíng tính.
(+ ): Phản ứng hcfi rõ {+ +): Phản ứng rõ (+ + + ): Phản ứng rất rõ
Nhận xét: Qua các phản ứng định tính những nhóm hợp chất trên, sơ bộ kết luận trong nước sắc của bài thuốc có Flavonoid, Alcaloid, Coumarin, Iriđoid, Curcumin, chất béo, acid hữu cơ, acid amin; không có Glycosid tim, Saponin. Các nhóm hợp chất có mặt trong nước sắc đều có mặt trong các vị thuốc có trong bài thuốc như Flavonoid có trong Nhân trần, Thiên thảo, Hoa hòe; Alcaloid có trong Hoàng bá, Bạch thược; Coumarin có trong Thiên thảo, Đương Qui, Iridoid có trong Sinh địa, Chi tử; Curcumin có trong Uất kim; chất béo có trong Đưcmg quy, Uất kim; ad d hữu cơ có khá nhiều trong Bạch thược (acid benzoic: 1,07%); acid amin có trong Sinh địa, Đương quy...C hính các vị thuốc đã tạo nên sự phong phú về thành phần hóa học của nước sác bài thuốc.
2.2A 2 . Phân tích môt s ố nhóm chất của bài thuốc bằns sắc ký lỚD m ỏns và đốỉ chiếu với các vi thuốc