(1) Định tính alcaloid.
Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 10ml dung dịch H2SO4 1N, đun đến sôi, để nguội. Lọc vào một bình gạn, kiềm hoá dịch lọc bằng dung dịch ammoniac đặc (pH 9 – 10), sau đó lắc với ether (hoặc chloroform) 2 – 3 lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết lại, đem lắc với acid H2SO4 1N hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước, chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml. Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 -3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:
Ống 1: thuốc thử Mayer: xuất hiện tủa màu trắng.
Ống 2: thuốc thử Dragendorff: xuất hiện tủa màu da cam. Ống 3: thuốc thử Bouchardat: xuất hiện tủa màu nâu.
Kết luận: dược liệu có alcaloid
Định tính flavonoid.
Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 50ml cồn 90o. Đun cách thuỷ sôi trong vài phút. Lọc nóng. Dịch lọc được làm các phản ứng định tính:
-Phản ứng Cyanidin.
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magie kim loại ( khoảng 10mg). Nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc (3 – 5 giọt). Cho 1ml dịch chiết vào một ống nghiệm khác để làm ống chứng. Để yên một vài phút, ống thử không chuyển màu.
Kết luận: phản ứng âm tính. -Phản ứng với kiềm loãng.
Cho 1ml dịch chiết trên vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Xuất hiện tủa vàng, khi thêm 1ml nước cất, tủa không tan.
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc. Hơ khô rồi để yên trên miệng lọ chứa ammoniac đặc. Nhỏ 1 giọt khác làm chứng. Màu vàng của vết dịch chiết không đậm hơn màu của vết ống chứng.
Kết luận: phản ứng âm tính.
-Phản ứng với dung dịch FeCl3.
Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%. Xuất hiện tủa xanh đen.
Kết luận: phản ứng dương tính.
Kết luận: dược liệu không có flavonoid
Định tính anthranoid toàn phần: cho 2g bột dược liệu vào bình nón 100ml, thêm 15ml dung dịch acid H2SO4 1N. Đun trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn đến sôi. Tiếp tục lọc và chiết như trên.
Lấy 1ml dịch chiết, thêm 1ml dung dịch ammoniac. Lắc nhẹ. Lớp nước khôngcó màu đỏ sim.
Lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước không có màu đỏ sim
Kết luận: phản ứng âmtính.
Kết luận: dược liệu không có anthranoid toàn phần. Định tính coumarin.
Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 50ml cồn 90o, đun cách thuỷ trong khoảng 3 – 5 phút. Lọc nóng qua giấy lọc, dịch chiết thu được làm các phản ứng sau:
Phản ứng mở vòng lacton: cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch chiết. Ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Ống 2 để nguyên. Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội. Ống 1 có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng. Ống 2 trong. Thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều. Ống 1 trong suốt. Ống 2 có tủa đục. Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 trở lại tủa đục như ống 2.
Kết luận: phản ứng dương tính.
Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại): Nhỏ vài giọt dịch chiết coumarin lên giấy thấm. Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%. Sấy nhẹ. Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khoá, đồng xu…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang không sáng hơn phần bị che. Tiếp tục chiếu tia tử ngoài thấy phát quang của hai phần không thay đổi.
Kết luận: phản ứng âm tính.
Kết luận: dược liệu không có coumarin Định tính glycosid tim.
Lấy khoảng 10g dược liệu khô đã tán nhỏ cho vào một bình nón dung tích 250ml. Thêm 100ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100ml. Thêm vào dịch chiết 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào
một ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat.
Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Chiết glycoside tim bằng cách lắc với chloroform 2 lần, mỗi lần 8ml. Gạn lớp chloroform vào một cố có mỏ đã được sấy khô. Gộp các dịch chiết chloroform và loại nước bằng NaSO4
khan.
Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô. Đặt các ống nghiệm lên giá và bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến khô. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính.
- Phản ứng của khung steroid: phản ứng Liebermann – Burchardat.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá.
Kết luận: phản ứng dương tính. -Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh: + Phản ứng Baljet:
Pha thuốc thử Baljet: cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycosid tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha cho đến khi xuất hiện màu đỏ da cam. So sánh màu sắc với ống chứng là ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng.
Kết luận: phản ứng âm tính. + Phản ứng Legal.
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycoside tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều sẽ xuất hiện màu đỏ cam. So sánh màu sắc với ống chứng là
ống không có cắn glycosid tim thấy ống thử có màu đỏ cam không đậm hơn ống chứng.
Kết luận: phản ứng âm tính.
- Phản ứng của phần đường 2,6 – desoxy: phản ứng Keller – kiliani. Cho vào ống nghiệm chứa cắn glycoside tim 0,5ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn. Thêm vài giọt dung dịch sắt III clorid 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 45o. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng sẽ xuất hiện 1 vòng tím đỏ.
Lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá. Kết luận: phản ứng dương tính.
Kết luận: dược liệu không có glycosid tim. Định tính saponin.
Lấy 2g bột dược liệu, cho vào bình nón 100ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc. Dịch lọc cho vào ống nghiệm và lắc ống nghiệm 5 phút dọc theo chiều dọc, để yên 15 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt. Bọt không tan sau 15 phút.
Kết luận: phản ứng dương tính.
Kết luận: dược liệu có saponin. Định tính tanin.
Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính:
- Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt FeCl3 5%: xuất hiện tủa xanhđen. - Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10%: xuất hiện tủabông. - Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1%: xuất hiệntủa bôngtrắng.
Kết luận: phản ứng dương tính.
Kết luận: dược liệu có tanin.
Nhỏ 1 – 2 giọt nước cất lên phiến kính nhỏ. Dùng kim mũi mác lấy 1 ít dược liệu để vào giọt ước. Đậy lam kính lên, rồi nhỏ 1 – 2 giọt dung dịch iod – iodid loãng vào cạnh lam kính, dung dịch iod – iodid thấm vào trong, lau khô. Soi dưới kính hiển vi thấy các hạt tinh bột màu xanh.
Kết luận: phản ứng dương tính.
Kết luận: dược liệu có tinh bột
(4) Định tính đường khử tự do.
Lấy 1g bột dược liệu cho vào một ống nghiệm 20ml. Thêm vào đó 10ml nước cất, đun cách thuỷ 3 – 5 phút. Lọc nóng, lấy dịch lọc thử phản ứng sau: cho 2ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vào đó 0,5ml thuốc thử Fehling A và 0,5ml thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thuỷ vài phút, thấy xuất hiện tủa đỏ gạch.
Kết luận: phản ứng dương tính.
Kết luận: dược liệu có đường khử tự do
(5) Định tính acid hữu cơ.
Cho khoảng 2g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 5ml nước cất đun sôi trực tiếp trong 10 phút, để nguội, lọc. Lấy dịch lọc cho thêm ít tinh thể NaCO3. Quan sátthấy bọt khí bay lên.
Kết luận: phản ứng dương tính.
Kết luận: dược liệu có acid hữu cơ
Kết luận chung: trong củ bình vôi nghiên cứu chứa alcaloid, saponin, tanin, tinh bột, đường khử tự do, acid hữu cơ, trong đó alcaloid là thành phần chính.
Bảng 3.1. Bảng kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu củ.
TT Tên nhóm chất Phản ứng Kết
quả
Kết luận
1 Alcaloid Thuốc thử Mayer Thuốc thử Dragendorff Thuốc thử Bouchardat ++++ ++++ ++++ Dương tính
TT Tên nhóm chất Phản ứng Kết quả
Kết luận
2 Glycosid tim Liebemann Burchardt Baljet Legal Keller – kiliani + - - ++ Âm tính
3 Saponin Chiết bằng nước nóng, lắc ++++ Dương tính
4 Đường khử Fehling +++ Dương tính
5 Anthranoid toàn phần
Với dung dịch ammoniac Với dung dịch NaOH
- -
Âm tính
6 Coumarin Phản ứng mở vòng lacton Quan sát huỳnh quang
+ -
Âm tính
7 Tanin Với FeCl3
Với chì acetat Với gelatin ++++ ++++ ++++ Dương tính. 8 Flavonoid Cyanidin Phản ứng với kiềm: Với FeCl3 - - ++ Âm tính Ghi chú: +: Phản ứng dương tính ++: Phản ứng lên khá rõ. +++: Phản ứng lên rõ. ++++: Phản ứng lên rất rõ.