PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình tổng hợp có xuất xứ từ các công ty như: Merk, Sigma-Aldrich, Trung Quốc,v.v… Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Các hóa chất được trình bày ở bảng dưới đây:
TT Nguyên liệu Xuất xứ TT Nguyên liệu Xuất xứ
1 2- Methylbenzaldehyd Merk 16 Ethylacetat Trung
Quốc
2 3- Methylbenzaldehyd Merk 17 Nước cất VN
3 2-Trifloromethylbenzaldehyd Merk 18 CDCl3 Merk
4 3-Trifloromethylbenzaldehyd Arcros 19 DMSO-d6 Merk
5 2-
Trifloromethoxybenzaldehyd
Arcros 20 Dimethylformamid Merck
6 3-
Trifloromethoxybenzaldehyd
Arcros 21 Khí H2 Việt
Nam
7 2- Florobenzaldehyd Merk 22 Acid 5-cloro-2-nitrobenzoic Merk
8 3- Florobenzaldehyd Merk 23 2-amino-4-methylbenzonitril Merk
9 Naphthalen-1-carbaldehyd Merk 24 Acid5-methyl-2-nitrobenzoic Merk
10 Methanol Merk 25 Ammonia Water Trung
Quốc
11 Ethanol Trung
Quốc
26 NaHSO3 Trung
Quốc
12 Diclomethan Merck 27 N,N-dimethylacetamid Merk
13 n-N-hexan Malaysia 28 Dimethylamin 40% Fischer
14 Aceton Trung Quốc 29 Thionylclorid Merk 15 KOH Trung Quốc 30 10% Pd/C Merk
16
2.2. THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM
Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 2 cổ dung tích 100ml, bình cầu 100ml, 50ml, sinh hàn, phễu, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner, bình nón, bình chiết… Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản).
Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ). Máy cất quay Buchi R – 210 (Thụy Sỹ). Tủ sấy Memmert (Đức).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) được ghi trên máy phổ AVANCE Spectrometer AV500 (BRUKER, Đức), Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Máy đo phổ khối khối lượng LC-MSD-Trap-SL - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Máy đo phổ hồng ngoại được ghi trên máy Perkin Elmer tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital. Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức).
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp tổng hợp 2- aryl-4-quinazolinon
Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ kinh điển và hiện đại để tổng hợp các dẫn chất dự kiến.
Theo dõi tiến trình phản ứng và sơ bộ đánh giá độ tinh khiết các chất bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM).
2.3.2. Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc
Sử dụng phương pháp sắc ký như: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng (SKLM) và phương pháp kết tinh để tinh chế các hợp chất tổng hợp được.
Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được như: phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- NMR và 13C-NMR), phổ khối lượng (LC_MS).
17
2.3.3. Phương pháp xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được theo phương pháp MTT là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro [14, 31].
2.3.3.1. Nguyên tắc:
Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót của tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng.
Hợp chất MTT có tên khoa học là 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5- diphenyltetrazolium bormid, có màu vàng được thêm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37oC, 5% CO2. Màu vàng biến đổi thành formazan tím trong ty thể của tế bào sống. Khả năng hấp thụ của dung dịch có màu này có thể được định lượng bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 540 – 600nm. Sự biến đổi màu chỉ xảy ra khi enzym reductase trong ty thể hoạt động, và như vậy sự chuyển đổi liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót. Nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu độc tính của các dẫn chất tổng hợp được trên bốn dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư biểu mô - KB, tế bào ung thư gan - Hep – G2, tế bào ung thư phổi - LU, tế bào ung thư vú - MCE – 7. Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI).
2.3.3.2. Dòng tế bào thử nghiệm:
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: - KB (Human epidemic carcinoma) – tê bào ung thư biểu mô. - Hep – G2 (Hepatocellular carcinoma) – tế bào ung thư gan. - LU (Human lung carcinoma) – tế bào ung thư phổi.
- MCF - 7 (Human breast carcinoma) – tế bào ung thư vú. -
18
2.3.3.4. Tiến hành:
a. Chuẩn bị tế bào.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối).
Tùy thuộc vào các đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau.
Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
b. Quy trình xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư.
- Pha 200 l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào HepG2, MCF7, KB, LU. - Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 g/ml; 32 g/ml;
8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml. Ủ ở 37oC, 5% trong 3 ngày.
- Giếng điều khiển (đối chứng dương) chỉ gồm 200 l dung dịch tế bào 3 x 104 tế bào/ml.
- Sau 3 ngày nuôi cấy; ủ tiếp với MTT 0,2mg/ml ở 37oC trong 4 giờ.
- Loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều để formazan có thể hòa tan hoàn toàn.
- Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm trên máy Spectrophotometter Genios TECAN. Mật độ quang phản ánh số lượng tế bào còn sống sót.
c. Tính kết quả:
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) được tính toán dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:
IC(%) = 100 x
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính tablet curve.