- Tiến hàn h:
2. 1.1 Tách dexamethason bằng sắc ký lốp mỏng
PDA jjgk Genesis
jjgk Genesis Dexa 1 O ppm L C - PDA 1- T Ị - t t t I I I I I I I I I ^ I I I I I I I I I I I I I I Ị I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Ị I 1 2 3 4 Tim e (min) 240.0
Hình 2.4. Sắc ký đồ của dung dịch dexamethason 10 ppm phân tích bằng HPLC
Nhận xét: Kết quả khảo sát sắc ký đồ cho thấy, với tốc độ dòng 0,5 mL/phút, dexamethason có thời gian lưu là 1,39 phút, pic cân xứng. Trong pha động dexamethason có cực đại hấp thụ ở 240nm.
2.2.2.2. Khảo sát điều kiện khối phổ
Sử dụng dung dịch dexamethason 10 H-g/mL pha trong pha động để khảo sát. Bơm trực tiếp dung dịch chuẩn vào hệ thống MS qua syringe chuẩn Unimetric.
a. Tối ưu hoá các điều kiện bắt ion
Chạy chương trình Tune plus để tối ưu hoá điều kiện bắt ion, kỹ thuật positive ESI để ion hoá.
- Gọi chương trình Tune Plus để xác định điều kiện khối phổ
+ Bật máy khối phổ, khỏi động phần mềm và gọi phương pháp bằng cách:
1 50000-Z 1OOOOO^ 1OOOOO^ 5 0 0 0 0 ^
O—Ị-r
Trên cửa sổ chương trình Instrument Setup, chọn biểu tượng máy khối phổ LQC Advantage MS sẽ xuất hiện hình máy khối phổ
+ Bơm dexamethason vào hệ thống khối phổ với tốc độ 5 nL/phút, sau một thời gian sẽ xuất hiện ion phân tử (mảnh mẹ). Dexamethason có phân tử lượng là 392,5 và mảnh ion phân tử có m/z = 393,5 do proton hoá như hình 2.5
C:\XcaliburV..\Dexa base lOppm MS OI + ESỈ full MS 200 -600, CE = o
Dexa base lOppm MS OI #1 RT: 0.02 AV: 1 NL: 8.08E3
T: + p ESI Full ms [ 200.00-600.00] 392.9 392.9 100- 30^7 332.8 41,2.8 424.7 300 400 m/z 500 600
H ìn h 2.5. Phổ khối (1 lần) của dung dịch dexamethason 10 ppm, CE=0 V
+ Nhấp chuột vào Tune Plus, xuất hiện cửa sổ màn hình Tune Plus, chọn chế độ Positive ESI (+ESI) trên cửa sổ màn hình.
Trong ô Mass (m/z) đánh số 393,5, máy sẽ tự động điều chỉnh và tối ưu hoá các thông số để bắt ion m/z= 393,5 tốt và nhạy nhất. Quá trình này mất khoảng 3-5 phút. Sau khi đã tự động điều chỉnh, trên màn hình sẽ thấy tín hiệu của ion m/z =393,5 lớn hơn ban đầu. Lưu file Tune lại, đặt tên là
b. Khảo sát khối phổ
Ở chế độ MS 1 lần Full scan, năng lượng va chạm CE = 0 ta thu được phổ khối như hình 2.6, dựa vào đó ta có thể xác định được mảnh ion mẹ 393,5
- Sử dụng năng lượng va chạm CE, ở mức 10 V, do năng lượng còn yếu nên chưa thấy xuất hiện mảnh con.
Dexa base lOppm MS 05 (10V)
+ ESI full MS 200 -600, CE = 1Q________________________________________________
Dexa base lOppm MS 05 (10V) #1 RT: 0.01 AV: 1 NL: 7.44E6
T: + c ESI sid=1 0.00 Full ms [ 100.00-450.00]
m/z
mảnh ion 373 và mảnh 355. (hình 2.7)
Dexa base 1 Oppm MS 04 (20V)
+ ESI full MS 200 -600, CE = 20 ______________________________________________________________
Dexa base lO ppm MS 04 (20V) #1 RT: 0.01 AV: 1 NL: 3.68E6
T: + c ESI sid—20.00 Full ms [ 100.00 450.00]
- Khi tăng năng lượng lên CE = 20 V, xuất hiện trên phổ khối có thêm các
m/z
Hình 2.7. Phổ khối (1 lần) của dung dịch dexamethason 10 ppm, CE=20 V
Khi tăng năng lượng lên 30 V, tín hiệu các mảnh 373, 355 tăng lên.(hình 2.8)
Dexa base 10ppm MS 03 (30V)
-«-ESI full MS 200 -600, CE = 30_________________________________________________________________ Dexa base 10ppm MS 03 (30V) #1 RT: 0.01 AV: 1 NL: 1.33E6
T: + c ESI sid=30.00 Full ms [ 100.00-450.00]
Ở chế độ MS 2 lần, với CE = 20 V cũng xuất hiện trên phổ khối mảnh 373 và 355 tăng lên (hình 2.9)
Dexa base lOppm MS2 CE20#17 RT: 0.36 AV: 1 NL: 3.49E4
T: + p ESI Full ms2 393.50@20.00 [ 105.00-450.00]100^ 37* 1 100^ 37* 1 90£ 80 70d 60- 50- 40-; 30 - 20~z 10 355.1 337.2 309.0 149.0 1—I—I—I—]—I—r 150 201.0 237.3 J L ....ị . , ,J , il, 274.6 200 “ 250I I 393.0 300
ĩ "r I—r~I—r—\—I—I—I—I—I
350 400 450
m/z
Hình 2.9. Phổ khối MS2, dung dịch dexamethason 10 ppm, CE = 20 V
Nhận xét: Kết quả khảo sát MS cho thấy dexamethason có 3 mảnh đặc trưng: - Mảnh mẹ (ion phân tử) m/z 393,5 ± 1 amu ; mảnh này có tín hiệu cao và ổn định, sử dụng để định lượng.
- 2 mảnh con m/z 393,5 -> ( 373; 335) amu ở năng lượng E= 30V; 2 mảnh này kết hợp vói mảnh mẹ sử dụng để định tính.
c. Tối ưu hoá bắt ion dưới điều kiện sắc ký
Do quá trình khảo sát trên, sử dụng tốc độ dòng thấp (5|j.L/phút) nhưng trong kết nối LC- MS, tốc độ dòng thường vào khoảng 0,5 - 1 mL/phút. Do đó, cần thiết phải sử dụng khí làm bay hơi dung môi và phải tối ưu hoá bắt ion ở điều kiện sắc ký.
Bơm mẫu từ syringe chuẩn trộn với dòng sắc ký qua bộ trộn chữ T (Tunion), ở
Để làm bay hoi dung môi, sử dụng khí nitơ có tốc độ là 30 đơn vị (SG = 30), tiến hành chạy chương trình Tune Plus như trên. Lưu file với tên
Dexamethason Flow 0,2 mLph.LCQTune. File này được sử dụng trong quá trình phân tích LC-MS.
d. Phân tích mẫu bằng LC-MS
❖ Chương trình sắc ký: Như ở mục 2.1.4.3
Điều khối phổ:
mẴjL
+ Chế độ phun scan (MS llần, MS 2 lần) với các ion đặc trương 393; 373; 355 để định tính
+ Chế độ SIM, sử dụng tín hiệu của ion phân tử 393 để định lượng
+ File lưu điều kiện khối phổ đã tối ưu: Dexamethason Flow ớ,2 mLph.LCQTune
Vói chương trình sắc ký trên, sắc ký đồ của dexamethason được ghi ở hình 2.10 Dexa 10 ppm LC - PDA_07041 01 72405 R T : 1.39 A A : 3 1 7 1 0 2 1 3 8 NL: 1.93E7 TIC MS O e n e s is D e xa 1 o ppm LO - PDA_0704101 72405 100- 8Ch 6 0 - 4 0 - 20- 393.1 30 0 3 0 3 -3 3 3 3 .5 367^2 39QJ3 — . V I ' V i , V , ' Ị T V V I I 'I' 'I I ' ' i r n - v r ị - r T r T ĩ - 3 5 0 _3R4.1 395.1 4 0 0 m/z 4 3 3 .5 4 5 5 .6 4 7 3 .0 493.1 I' ' í " 1' 1' '' ' l ' -| 1 1 v 1 r I ' | V I" ' 1 i " | ' V ị ' i'- r r V | ' i " i T I fĩ ĩĩT i ' I 4 5 0 5 0 0
❖ Chuẩn bị mẫu:
- Dãy các dung dịch chuẩn: Pha các dung dịch chuẩn trong pha động có nồng độ từ 0,1 - 5 |ng/mL.
- Dung dịch thử ị chiết từ mẫu MI và M3):
+ Cách 1: Hút 50 |iL dung dịch thử ở phần chấm sắc ký vào bình định mức 25 mL, thêm pha động vừa đủ. Nếu mẫu thử có trộn dexamethason (M3), nồng độ dexamethason sẽ là 2 \xg/mL
+ Cách 2: Cân lượng mẫu thuốc đông dược có chứa khoảng 0,1 mg dexamethason vào bình định mức 50 mL, thêm khoảng 30 mL pha động,lắc siêu âm khoảng 10 phút. Thêm pha động vừa đủ, mẫu thử có nồng độ dexamrethason 2 1-ig/mL.
Mẫu thử và chuẩn được lọc qua màng lọc Millipore 0,45 |_im, tiêm vào hệ thống LC-MS cùng điều kiện.