. 1 Phương pháp chiết xu t, phân lập hợp c ht
3.1.Kết quả chiết xuất, phân lập hợp chất
Mẫu lá cây Gan heo được chiết xuất như sau:
Mẫu lá cây Gan heo được phơi khô, nghiền thành bột (6,5 kg), sau đó chiết trong ethanol 3 lần, mỗi lần dùng 8 lít dung môi. Sử dụng chiết bằng thiết bị chiết siêu âm (50°C, 3 giờ). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp dịch chiết 3 lần lại và cất loại dung môi ở áp suất giảm thu được 630,0 g cặn chiết ethanol.
Lấy 120 g cặn chiết này phân tán vào 1,2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexan và ethyl acetat; mỗi dung môi được chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần khoảng 1,5 lít dung môi, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng. Các dịch chiết n-hexan, ethyl acetat được cất thu hồi dung môi thu được các cắn tương ứng n-hexan (H, 31,0 g) và ethyl acetat (E, 56,0 g) và lớp nước (N, 33,0 g).
Dược liệu (6,5 kg)
Chiết với EtOH (3 lần × 8 lít)
Dịch chiết EtOH (120 g)
Thu hồi dung môi, h a tan thành nhũ dich trong H₂O.
Lắc phân đoạn với n-hexan (3 lần × 1,5 lít)
Thu hồi dung môi Phân đoạn n -hexan
(H: 31 g)
Phân đoạn EtOAc (E: 56 g)
Thu hồi dung môi
Phân đoạn EtOH Phân đoạn H₂O
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá cây Gan heo
Phân đoạn ethyl acetat từ lá cây Gan heo được phân lập thô bằng cột silica gel như sau:
Giai đoạn phân lập 1.
Sử dụng phương pháp sắc kí cột - Chuẩn bị cột:
+ Cặn chiết ethyl acetat (50,0 g được triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, trộn cặn với lượng tối thiểu silicagel, sấy khô và nghiền mịn.
+ Cột được rửa sạch, đáy cột được lót 1 l ớ p bông mỏng. Đổ vào cột 40ml chloroform mở khóa cho dung môi ch ảy từ từ để đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài. Khi lớp dung môi còn khoảng 3 cm thì khóa cột.
+ Cột được nhồi bằng phương pháp nhồi cột ướt: trộn silica gel với một lượng vừa đủ dung môi chloroform thành hỗn dịch rồi đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh cột để hạt nén, thoát hết bọt khí trong cột và phân bố đều, bằng mặ t, rửa thành cột bằng chloroform.
+ Ổn định cột: Sau khi luyện cột, ta kiểm tra cột xem có thẳng, và không còn bọt khí thì ta đậy nắp cột và ổn định cột trong vòng 24h. - Tiến hành sắc kí cột hấp thụ
+ Mở khóa cột cho dung môi chloroform chảy đến sát bề mặt silica gel, khóa cột lại.
+ Đưa chất lên cột: Đổ phần cặn đã được trộn với silica gel lên trên, v ừa dội vừa gõ nhẹ để phần cặn sát bề mặt silica gel, lót 1 lớp bông mỏng lên bề mặt silica gel.
+ Sau đó rửa giải bằng dung môi và bắt đầu chạy cột. Hệ dung môi rửa giải là chloroform/methanol, tỉ lệ thay đổi từ 30:1 đến 1:1.
+ Điều chỉnh tốc độ rửa giải là 1ml/1 phút.
+ Mỗi ống nghiệm hứng khoảng 10ml dung dịch. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc kí lớp mỏng và thu các phân đoạn giống nhau. Thu được 4 phân đoạn E1 (6,0 g), E2 (14,2 g), E3 (6,3 g), E4 (8,4 g).
Giai đoạn phân lập 2.
+ Phân đoạn E4 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp chloroform/ aceton/ nước (3:4:0,1), thu được 5 phân đoạn nhỏ là E4.1 (1,6 g), E4.2 (1,4 g) và E4.3 (1,2 g), E4.4 (0,8 g) và E4.5 (0,6 g).
+ Tinh chế phân đoạn E4.1 bằng cột sắc ký pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải aceton/nước 3:2, v/v thu được hợp chất 1 (23 mg). Phân tách phân đoạn E4.3 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan/ aceton 7:3, v/v thu được hợp chất 2 (11 mg).
Cao Ethyl acetat 50 g
Silica gel pha thuận (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cloroform/ methanol (30:1 đến 1:1)
E1 (6 g)
Silica gel pha thuận
Cloroform/aceton/H₂O (3:4:0.1)
E4.1 (1,6 g)
Hợp chất 1 (23 mg)
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat
3.2. Xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây Gan heo
3.2.1. Hợp ch t 1
Tính chất: Chất bột màu trắng, vô định hình. Độ quay cực: [α 25D = -64,2(c =0,1, MeOH). Phổ ESI-MS: m/z 277,0 [M+H]+
Khối lượng phân tử: 276. Công thức phân tử: C16H22O4 Phổ NMR trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp ch t C16H22O4 và ch t so sánh L Vị trí C 2 3 3a 4 4a 5 6 7 8 8a 9 28
9a 10 11 12
Hợp chất 1 thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ ESI-MS của hợp chất 1 xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 277,0 [M+H]+, tương ứng với M= 276 và có thể có công thức phân tử C16H20O4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 thấy có tín hiệu của 2 proton olefin ; 1 nhóm methoxy và 3 nhóm methyl. Phổ 13C- NMR và DEPT của hợp chất 1 xuất hiện 16 carbon trong đó có: 1 carbonyl, 4 carbon không liên kết với hydro, 4 carbon methin, 3 carbon methylen và 4 carbon methyl. Trên phổ HMBC của hợp chất 1 xuất hiện tương tác HM giữa H-10 δH 1,41)/H -11 δH 1,23) với C-3a δC 171,0)/C-4 δC 38,6)/C-4a
δC 47,1); giữa H-3 δ H 5,912) với C-2 δC168,9)/C-3a δC 171,0)/C-9a δC
106,8 đã xác định vị trí của 2 nhóm methyl tại C-4, liên kết đôi tại C-3/C-3a. Tương tác HM giữa nhóm methoxy δH 3,20) và C-9a δC 106,8 đã xác định vị trí nhóm methoxy gắn trực tiếp tại C-9a. Dựa vào dữ liệu phổ của hợp chất 1 và so sánh với số liệu đã công bố của hợp chất O-methyl-6-oxofurodysinin lacton [22] thấy trùng khớp các vị trí tương ứng.
Vì vậy, xác định hợp chất 1 là O-methyl-6-oxofurodysinin lacton.
Hình 3.3. C u trúc phân t 1
3.2.2. Hợp ch t 2
Tính chất: Hợp chất 2 có dạng tinh thể không màu, tan trong CHCl3. Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3 δ ppm có kết quả như sau: 7,59 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-3′ , 7,09 1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′ , 7,05 1H, d, J = 1,8 Hz, H-5′ , 6,93 1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′ , 6,30 1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′ , 5,85 (1H, br s, OH-7′ , 4,72 1H, d, J = 8,8 Hz, H-3), 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H-24), 3,94 (3H, s, OCH3-6′ , 1,68 3H, s, H3-26), 1,62 (3H, s, CH3-27), 0,98 (3H, s, CH3-29), 0,97 (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-30), 0,90 (3H, s, CH3-28), 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-21), 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH2-19), 0,38 (1H, d, J = 4,4 Hz, CH2-19).
Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 cho thấy đây là hợp chất triterpenoid có dạng khung cycloartane. Các tín hiệu của cyclopropane methylene tại δH 0,38 (1H, d, J =4,4 Hz, CH2-19) và 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH2-19); bốn nhóm methyl bậc ba tại δH 0,98 (3H, s, CH3-29), 0,97 (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-30), 0,90 (3H, s, CH3-28); một nhóm methyl bậc hai tại δH 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-21); một nhóm methylene tại δH 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H-24). Một nhóm feruloyl được xác định dựa trên tín hiệu proton tại [δH 7,59 (1H, d, J =15,8 Hz, H-3′ , 7,08 1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′ , 7,04 1H, d, J =
1,8 Hz, H-5′ , 6,92 1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′ , 6,30 1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′ , 5,85 (1H, br s, OH-7′ ; và 3,94 3H, s, O H3-6′ liên kết với C-3 được xác
định dựa vào độ chuyển dịch hóa học ở trường thấp của H-3 δH 4,72 được so sánh với cycloartenol δH-3 4,72) trong tài liệu [29]. Nhóm feruloyl được xác định định hướng β dựa trên hằng số ghép cặp proton-proton giữa H-2ax và H- 3ax (J = 8,8 Hz). Dựa vào dữ liệu phổ của hợp chất 3 và so sánh v ới dữ liệu phổ đã công bố của hợp chất cycloartanyl ferulat [37 , xác định hợp chất 2 là Cycloartenyl ferulat.
Hình 3.4. C u trúc phân t
3.3. Bàn luận
Đề tài đã chiết xu ất cao toàn phần từ phần trên mặt đất lá cây Gan heo bằng phương pháp ngâm tại nhiệt độ 50oC với dung môi cồn 96°. Phương pháp có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền thu được khối lượng cắn toàn phần đạt 9,69% so với lượng dược liệu ban đầu. Cắn toàn phần sau đó được chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần là nhexan, ethyl acetat , thu được lần lượt các cắn phân đoạn với khối lượng đạt 0,48% ; 0,86% ; so với nguyên liệu khô ban đầu.
Đề tài đã phân lập 02 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat của mẫu nghiên cứu. Dựa theo đặc điểm lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy), phổ khối (APCI-MS, ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C- NMR, D PT và qua đối chiếu với các tài liệu đã công bố, 2 hợp chất này
được xác định lần lượt là: O-methyl-6-oxofurodysinin lacton (1) và Cycloartenyl ferulat (2). Cả 2 hợp chất này đều chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào trước đây về lá Gan heo. Vì vậy, đây là đóng góp mới của đề tài, làm phong phú hơn tri thức về thành phần hóa họ c của cây Gan heo.
Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton
Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton được tìm thấy ở hai loài Hải miên Dysidea Fragilis và Haliclona Oculata [5] và trong da của loài (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cadlina Luteomarginata [23].
Hợp chất o-methyl-6-oxofurodysinin lacton được chứng minh là có tác dụng : chống hoạt tính gây độc tế bào ung thư. ác hợp chất phân lập từ loài hải miên Dysidea fragilis được đánh giá sàng lọc sơ bộ ở nồng độ 100 g/mL có hoạt tính gây độc tế bào trên 8 dòng tế bào ung thư KB, LU-1, HL-60, LnCaP, SK-MeI2, HepG2, MCF-7, PC-3.
Kết quả cho thấy, hợp chất có khả năng ức chế >50% sự phát triển tế bào ung thư [5].
Hợp chất cycloartenyl ferulat
Hợp chất cycloartenyl ferulat được tìm thấy trong dầu cám. Là một loại -Oryzanol, một hợp chất được tạo thành từ : este axit ferulic và rượu triterpene với phytosterols. Chúng có nhiều lợi ích sức khoẻ đã khảo sát từ gạo và các s ản phẩm gạo. Nhóm chất đã được chứng minh khoa học có chất chống oxy hoá, chống viêm, chống khối u, và làm giảm kali máu, đã được được ch ấp thuận để điều trị mất cân bằng thần kinh và rối loạn mãn kinh [37].
Cụ thể hơn, hợp chất cycloartenyl ferulate, một thành phần của gamma- oryzanol có nguồn gốc từ dầu cám gạo làm suy giảm sự phân huỷ của tế bào Mast. Trong nghiên cứu này, các nhà khoa học kiểm tra ảnh hưởng của cycloartenyl ferulate (cycloartenolferulic axit este; CAF) về phản ứng dị ứng. Khi CAF và gamma-oryzanol được tiêm dưới da với DNP (phức DNA và
protein) chống lại IgE vào da lưng của chuột, phản ứng quá mẫn da trên da do thụ thể kháng nguyên DNP-HSA giảm đi. F và gamma-oryzanol cũng ức chế sự giải phóng hạt của các tế bào Mast . IgE kết hợp với CAF không thể phát hiện được bằng kháng thể chống lại IgE trong phân tích ELISA. Mặc dù ủ IgE với CAF không làm giảm lượng Ig , nhưng có thể kết tủa IgE bằng cách ly tâm. Kết quả này chứng minh rằng CAF đã bắt giữ được Ig , ngăn cản nó gắn kết với FcepsilonRI, và giảm sự giải phóng hạt của tế bào Mast . Chính vì thế, chúng có tác dụng trong điều trị viêm dị ứng [27].
Một nghiên cứu khác chứng minh tác d ụng đa dạng của hợp chất cycloartenyl ferulate. Chiết xuất methanol của cám gạo và gamma-oryzanol đã ngăn chặn tình trạng gây viêm do 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) ở chuột . Các thành phần hoạt tính củ a cám gạo, sitosterol ferulate , 24-methylcholesterol ferulate , cycloartenyl ferulate và 24- metylenecycloartanol ferulate ức chế rõ ràng viêm TPA gây ra ở chuột. Liều ức chế 50% của các hợp chất này đối với viêm do TPA gây ra là 0,2-0,3 mg / con. Hơn nữa, cycloartenyl ferulate đã ức chế đáng kể tác dụng thúc đẩy khối u của TPA trong chuột nhắt. Như vậy, chất được khẳng định có hoạt tính chống viêm và chống phát triển khối u ở chuột [33].
Nhận xét: 2 các hợp chất phân lập được đều được chứng minh là có tác dụng sinh học, đồng th ời giúp ta định hướng được việc nghiên cứu thêm thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của lá cây Gan heo
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Qua quá trình hoàn thành thực nghiệm, luận văn đã thu đươc kết quả sau đây:
- Đã phân lập được 02 chất bằng phương pháp chiết bằng dung môi ethanol và sắc ký từ phân đoạn ethylacetat của dịch chiết lá Gan heo.
- Đã xác định được cấu trúc hóa học là o-methyl-6-
oxofurodysinin lacton (1) và cycloartenyl ferulat (2) dựa theo dữ liệu phổ thực nghiệm và so sánh với tài liều đã công bố. Cả 2 hợp chất này đều lần đầu tiên phân lập từ lá cây Gan heo.
2. Kiến nghị
o Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học cây Gan heo cả thành phần lá và phần trên mặt đất của cây.
o Dựa trên kết quả nghiên cứu thành phần hóa học , tiến hành nghiên cứu tác dụng sinh học của cây Gan heo trên người.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn á 2014 , điển ách h a thực vật h c iệt Nam, NX Giáo dục Việt Nam, tr 393.
2. Đỗ Huy ích, Đặng Quang hung, ùi Xuân hương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2011), Cây
thuốc v động vật làm thuốc ở Việt Nam, t ập III, Nhà xuất bản Khoa
học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 479-480. 3. Võ Văn
Giáo dục, tr 214-215. 4. Võ Văn
và kỹ thuật, tr. 957.
5. Nguyễn Thị Cúc (2017) Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa h c và
hoạt tính diệt tếung thư của hai loài hải miên Dysidea fragilis và
alicl na culata (tt)”, luận án Tiến sĩ hóa học, học viện Khoa học và
Công nghệ Việt Nam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6. Lưu Đàm ư (2005), “Nghiên cứu chiết tách nhuộm màu thực phẩm t
kinh nghiệm s dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số”, Trung tâm
hỗ trợ nghiên cứu hâu , Đại học Quốc gia Hà Nội.
7. Nguyễn Thượng Dong (2006), Nghiên cứu thuốc t thả dược, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
8. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1990), Phương pháp nghiên cứu
hóa h c cây thuốc, NXB y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh,
Khoa Dược.
9. Đỗ Văn Hải, Dương Đức Huyến (2011 , Đặc điểm hình thái các chi thuộc họ Ô Rô ( Acanthaceae Juss) ở Việt Nam. Hội nghị khoa h c
toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 4,Viện Sinh thái
và Tài nguyên sinh vật, tr. 104-108.
10. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây c Việt Nam, tập III, Nhà xuấ t bản trẻ, tr.73-74.
11. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr.518-520.
12. Nguyễn tập I, NX
13. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc v NXB Khoa học và Kỹ thuật, tr.432-438.
14. Viện Dược liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của
thuốc t thả dược, NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 139-141.
15. Phạm Kim Thoa (2017). Khóa luận “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật và
thành phần hóa h c của cây Lá Diễn”, khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia
Hà Nội.
16. Nguyễn Văn Thu và Trần Hùng (2011), ược liệu h c, I, NXB Y học.
17. Nguyễn Tiến Vững, Vũ Đức Lợi (2017), Một số hợp chất phân lập từ lá cây Gan Heo ( Dicliptera chinensis (L.) Nees). Tạp ch ược h c, T. 57, Số 7, trang 54 -57.
Tài liệu Tiếng Anh
18. Abdullahi, S.M, Musa, A.M, Abdullahi, M.I, Sule M.Iand Sani, Y.M. 2013 , Isolation of Lupeol from the Stem-bark of Lonchocarpus sericeus Papilionaceae , Scholars Academic Journal of Biosciences (SAJB), 1(1):18-19.
19.hmad 1, Khan MR, Shah N , Khan R 2013 In vitro antioxidant potential of Dicliptera roxburghiana. BMC Complement Altern Med, 13:140.
20. Ankita Wal, Pranary Wal, A.K. Rai, Kanwal raj (2010), Isolation and modification of pseudohybrid plant Lupeol , J.Pharm. Sci. & Res. Vol.2(1),13-25.
21. Bibhu Prasad Sahu, Panchanan Gouda and Chakrapani Patnaik (2016), Pandanus Odaritissimus Linn Prasad Sahu, Panchanan Gouda and Chakrapani Patnaik (2016), Pandanus Odaritissimus Linn: Isolation of Stigmast-5, 22-dien-3-β-ol from ethanolic extra of stem bark and study of antimicrobial activity , Journal of Chemistry and chemical Sciences, Vol.6(6), 574-585.
22. Charoenchai P, Vajrodaya S, Somprasong W, Mahidol C, Ruchirawat S, Kittakoop P (2010), “Antiplasmodial, cytotoxic, radical scavenging and antioxidant activities of Thai plants in the family Acanthaceae ,
23. Eric J. Dumdei, Julia Kubanek, John E. Coleman, Jana Pika, Raymond J. Andersen, Jorge Rios Steiner and Jon Clardy (1997), New terpenoid