- ác dụng cụ thí nghiệm thủy tinh: ống nghiệm, bình nón, bình gạn, cốc có mỏ, pipet...
- Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích, kính hiển vi.
- Phổ khối ESI-MS đo trên máy Varian gilent 1100 L -MSD tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Ph ổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 io ote, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết xu t, phân lập hợp ch t
Mẫu nghiên cứu sau khi được rửa sạch và phơi khô, thái nhỏ và ngâm chiết 3 lần trong dung môi ethanol, sử dụng chiết bằng thiết bị siêu âm (50oC, 3 giờ). Dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao toàn phần.
Phân tán cao chiết này trong nước rồi chiết phân bố với các dung môi theo thứ tự tăng dần độ phân cực là n-hexan và ethyl acetat. ác phân đoạn n- hexan, ethyl acetat được cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao từng phân đoạn tương ứng.
Dược liệu
Chiế t với ethanol Dịch chiết
ethanol
Cao tổng ethanol
Phân tán trong H2O
Lắc phân đoạn với n-hexan Thu hồi dung môi
Phân đoạn n- hexan
Lắc với ethyl acetat Thu hồi dung môi
Phân đoạn ethyl acetat
Hình 2.2: Sơ đồ chiết tách phân đoạn 18
Lựa chọn phân đoạn có tiềm năng bằng sắc kí lớp mỏng, tiến hành xử lý và phân lập. Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ các phân đoạn đã chọn chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký cột. ác phân đoạn trong quá trình phân lập được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng điề u chế.
Sắc ký cột : được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo, lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần. Silica gel pha thường cỡ hạt là 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.
Sắc ký lớp mỏng TL : được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 Merck , độ dày 0,2 mm và RP -18 F254s, độ dày 0,25 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, sau đó được phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và đốt nóng trên bếp điện từ.
Sắc ký lớp mỏng điều chế pTL : được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60G F254, độ dày 1,0 mm (Merck). Sau khi triển khai sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, đốt nóng trên b ếp điện từ, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất bằng dung môi thích hợp.
2.2.2. Phương pháp xác định c u trúc hợp ch t
Xác định cấu trúc của các chất phân lập được dựa trên phân tích kết quả phổ kh ối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), ngoài ra còn kết hợp với các thông số vật lí như Phổ tử ngoại- khả kiến (UV- VIS), Góc quay cực được đo bằng máy DIP- 360, Điểm nóng chảy
Mp và so sánh các dữ liệu thực nghiệm và các dữ liệu được công bố để đưa ra kết quả chính xác nhất.
a, Phổ khối lượng (MS)
Phổ khối lượng cung cấp những thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ phân tử. Phổ khối lượng không xác định trực tiếp khối
ion mà xác định tỷ lệ giữa khối lượng m và điện tích (z) của ion (m/z). Khi đó để xác định khối lượng phân tử (M) cần phải biết số điện tích của ion.
Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từ ion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định. Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽ tạo ra những phân mảnh giống nhau. Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử, cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của một chất chưa biết. So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [16].
b, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Khi đặt một chất có hạt nhân có s ố spin (I) lẻ 1H, 13 ... được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin h ạt nhân sẽ được sắp xếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cân bằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái. Nếu dùng một bức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu năng lượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từ trường . Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở về trạng thái cân bằng. Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tố trong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của các chất đó. ó 2 cách xác định năng lượng cộng hưởng này. Cách thứ nhất là xác định tần số cộng hưởng theo từng tần số trong suốt dải tần số cộng hưởng, cách này được gọi là cộng hưởng từ h ạt nhân quét. Cách thứ hai là ghi nhận đồng thời mọi tần số cộng hưởng rồi sử dụng biến đổi Fourier để tách riêng tần số cộng hưởng của từng hạt nhân. Kỹ thuật này được gọi là cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier (Fourier transform - NMR, FT - NMR) và là kỹ thuật sử dụng chủ yếu hiện nay [16].
Nguyên thuỷ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân là tần số cộng hưởng của các hạt nhân trong phân tử. Tuy nhiên, tần số hấp thu của hạt nhân thay đổi
theo từ trường ngoài B0. Để thuận tiện và loại bỏ ảnh hưởng của B0 trong số liệu phổ, người ta chia sự chênh lệch tần số cộng hưởng của hạt nhân so với một chất chuẩn thường dùng nhất là trimethyl silan, TMS) cho tần số cộng hưởng của chất chuẩn đó. Vì kết quả thu được (Hz/MHz) là rất nhỏ (phần triệu nên người ta dùng ppm để thể hiện giá trị cộng hưởng của các hạt nhân. Giá trị này thường được gọi là chuyển dịch hoá học. Giá trị chuyển dịch hoá học của các proton thường nằm trong khoảng 0-14 ppm, còn của carbon-13 là từ 0-240 ppm [16].
Như đã trình bày ở trên, tần số cộng hưởng của hạt nhân phụ thuộc vào từ trường của máy. Từ trường càng cao, dải tần số dùng để kích thích các hạt nhân càng rộng, phép đo càng nhạy và chính xác, độ phân giải ngày càng cao. Do vậy, ta thường gọi phổ kế cộng hưởng từ hạt nhân 200 MHz, 300 MHz hay 500 MHz... là theo tần số dùng để kích thích các proton [16].
Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 hay nhiều loại phổ khác nhau. Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13 như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối
tương quan giữa các loại h ạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [16].
Phổ cộng hưởng t ừ hạ t nhân một chiều
Phổ proton (1H-NMR hay proton NMR) cho biết môi trường hóa học của proton trong phân tử. ác proton có môi trường hóa học khác nhau sẽ dịch chuyển hóa học khác nhau. Phổ proton của 1 proton hay 1 nhóm proton có cùng môi trường hóa học thể hiện trên phổ có thể là 1 đỉnh. Đỉnh này có thể là đỉnh đơn, đôi, ba tới 7 đỉnh thành phần. Diện tích mỗi đỉnh tỷ lệ với số lượng proton của đỉnh. Dựa vào diện tích của đỉnh có thể biết số proton của đỉnh đó [16].
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) cung cấp các thông tin về môi trường hóa học của carbon. Carbon lai hóa sp3 không liên kết với dị tố chuyển dịch trong khoảng 0-60 ppm. Carbon liên kết đơn với oxy (alcol, ether) chuyển dịch trong khoảng 45-85 ppm. Carbon lai hóa sp2
chuyển dịch trong khoảng 100-150 ppm, nếu có liên kết đôi với oxy có th ể dịch chuyển tới 240 ppm. Với kỹ thuật đo phổ hiện tại, phổ NMR của carbon là những vạch đơn, mỗi vạch ứng với một carbon hơn 1 carbon nếu cũng có chung môi trường hóa học) của phân tử [16].
Các kỹ thuật xác định số lượng proton trên carbon cho biết số lượng proton liên kết trên mỗi carbon, gián tiếp cho biết số C và H trong phân tử. Kỹ thuật hiện thường sử dụng là DEPT (Detortionless Enhancement by Polarization Transfer) [16].
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Các kỹ thuật phổ hai chiều cho các thông tin về tương tác giữa C và H gắn trực tiếp trên nó, giữa các proton củ a carbon kế cận nhau (phổ COSY) hay phổ tương tác dị nhân (HETCOR) gi ữa proton và các carbon kế cận thường sử dụng hiện nay là kỹ thuật HSQC) hay xa hơn long-range
H T OR, thường dùng hiện nay là HMBC) hoặc giữa các proton gần nhau trong không gian (NOESY, ROESY) [16].
Với các kỹ thuật phổ NMR, người ta có thể biết được mối liên hệ giữa các proton và carbon trong phân tử. Kết hợp với phổ khối và các thông tin khác ta có thể xây d ựng và nhận dạng được cấu trúc phân tử của hợp chất [16].
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả chiết xuất, phân lập hợp chất
Mẫu lá cây Gan heo được chiết xuất như sau:
Mẫu lá cây Gan heo được phơi khô, nghiền thành bột (6,5 kg), sau đó chiết trong ethanol 3 lần, mỗi lần dùng 8 lít dung môi. Sử dụng chiết bằng thiết bị chiết siêu âm (50°C, 3 giờ). Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp dịch chiết 3 lần lại và cất loại dung môi ở áp suất giảm thu được 630,0 g cặn chiết ethanol.
Lấy 120 g cặn chiết này phân tán vào 1,2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexan và ethyl acetat; mỗi dung môi được chiết lặp lại 3 lần, mỗi lần khoảng 1,5 lít dung môi, thu được các phân đoạn dịch chiết tương ứng. Các dịch chiết n-hexan, ethyl acetat được cất thu hồi dung môi thu được các cắn tương ứng n-hexan (H, 31,0 g) và ethyl acetat (E, 56,0 g) và lớp nước (N, 33,0 g).
Dược liệu (6,5 kg)
Chiết với EtOH (3 lần × 8 lít)
Dịch chiết EtOH (120 g)
Thu hồi dung môi, h a tan thành nhũ dich trong H₂O.
Lắc phân đoạn với n-hexan (3 lần × 1,5 lít)
Thu hồi dung môi Phân đoạn n -hexan
(H: 31 g)
Phân đoạn EtOAc (E: 56 g)
Thu hồi dung môi
Phân đoạn EtOH Phân đoạn H₂O
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn lá cây Gan heo
Phân đoạn ethyl acetat từ lá cây Gan heo được phân lập thô bằng cột silica gel như sau:
Giai đoạn phân lập 1.
Sử dụng phương pháp sắc kí cột - Chuẩn bị cột:
+ Cặn chiết ethyl acetat (50,0 g được triển khai sắc ký trên cột silica gel pha thường, trộn cặn với lượng tối thiểu silicagel, sấy khô và nghiền mịn.
+ Cột được rửa sạch, đáy cột được lót 1 l ớ p bông mỏng. Đổ vào cột 40ml chloroform mở khóa cho dung môi ch ảy từ từ để đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài. Khi lớp dung môi còn khoảng 3 cm thì khóa cột.
+ Cột được nhồi bằng phương pháp nhồi cột ướt: trộn silica gel với một lượng vừa đủ dung môi chloroform thành hỗn dịch rồi đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh cột để hạt nén, thoát hết bọt khí trong cột và phân bố đều, bằng mặ t, rửa thành cột bằng chloroform.
+ Ổn định cột: Sau khi luyện cột, ta kiểm tra cột xem có thẳng, và không còn bọt khí thì ta đậy nắp cột và ổn định cột trong vòng 24h. - Tiến hành sắc kí cột hấp thụ
+ Mở khóa cột cho dung môi chloroform chảy đến sát bề mặt silica gel, khóa cột lại.
+ Đưa chất lên cột: Đổ phần cặn đã được trộn với silica gel lên trên, v ừa dội vừa gõ nhẹ để phần cặn sát bề mặt silica gel, lót 1 lớp bông mỏng lên bề mặt silica gel.
+ Sau đó rửa giải bằng dung môi và bắt đầu chạy cột. Hệ dung môi rửa giải là chloroform/methanol, tỉ lệ thay đổi từ 30:1 đến 1:1.
+ Điều chỉnh tốc độ rửa giải là 1ml/1 phút.
+ Mỗi ống nghiệm hứng khoảng 10ml dung dịch. Kiểm tra các dịch rửa giải bằng sắc kí lớp mỏng và thu các phân đoạn giống nhau. Thu được 4 phân đoạn E1 (6,0 g), E2 (14,2 g), E3 (6,3 g), E4 (8,4 g).
Giai đoạn phân lập 2.
+ Phân đoạn E4 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột silica gel pha thường, rửa giải bằng hỗn hợp chloroform/ aceton/ nước (3:4:0,1), thu được 5 phân đoạn nhỏ là E4.1 (1,6 g), E4.2 (1,4 g) và E4.3 (1,2 g), E4.4 (0,8 g) và E4.5 (0,6 g).
+ Tinh chế phân đoạn E4.1 bằng cột sắc ký pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải aceton/nước 3:2, v/v thu được hợp chất 1 (23 mg). Phân tách phân đoạn E4.3 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi hexan/ aceton 7:3, v/v thu được hợp chất 2 (11 mg).
Cao Ethyl acetat 50 g
Silica gel pha thuận
Cloroform/ methanol (30:1 đến 1:1)
E1 (6 g)
Silica gel pha thuận
Cloroform/aceton/H₂O (3:4:0.1)
E4.1 (1,6 g)
Hợp chất 1 (23 mg)
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat
3.2. Xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây Gan heo
3.2.1. Hợp ch t 1
Tính chất: Chất bột màu trắng, vô định hình. Độ quay cực: [α 25D = -64,2(c =0,1, MeOH). Phổ ESI-MS: m/z 277,0 [M+H]+
Khối lượng phân tử: 276. Công thức phân tử: C16H22O4 Phổ NMR trình bày ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp ch t C16H22O4 và ch t so sánh L Vị trí C 2 3 3a 4 4a 5 6 7 8 8a 9 28
9a 10 11 12
Hợp chất 1 thu được dưới dạng bột màu trắng. Phổ ESI-MS của hợp chất 1 xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 277,0 [M+H]+, tương ứng với M= 276 và có thể có công thức phân tử C16H20O4. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 thấy có tín hiệu của 2 proton olefin ; 1 nhóm methoxy và 3 nhóm methyl. Phổ 13C- NMR và DEPT của hợp chất 1 xuất hiện 16 carbon trong đó có: 1 carbonyl, 4 carbon không liên kết với hydro, 4 carbon methin, 3 carbon methylen và 4 carbon methyl. Trên phổ HMBC của hợp chất 1 xuất hiện tương tác HM giữa H-10 δH 1,41)/H -11 δH 1,23) với C-3a δC 171,0)/C-4 δC 38,6)/C-4a
δC 47,1); giữa H-3 δ H 5,912) với C-2 δC168,9)/C-3a δC 171,0)/C-9a δC
106,8 đã xác định vị trí của 2 nhóm methyl tại C-4, liên kết đôi tại C-3/C-3a. Tương tác HM giữa nhóm methoxy δH 3,20) và C-9a δC 106,8 đã xác định vị trí nhóm methoxy gắn trực tiếp tại C-9a. Dựa vào dữ liệu phổ của hợp chất 1 và so sánh với số liệu đã công bố của hợp chất O-methyl-6-oxofurodysinin lacton [22] thấy trùng khớp các vị trí tương ứng.
Vì vậy, xác định hợp chất 1 là O-methyl-6-oxofurodysinin lacton.
Hình 3.3. C u trúc phân t 1
3.2.2. Hợp ch t 2
Tính chất: Hợp chất 2 có dạng tinh thể không màu, tan trong CHCl3. Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3 δ ppm có kết quả như sau: 7,59 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-3′ , 7,09 1H, dd, J = 8,1, 1,8 Hz, H-9′ , 7,05 1H, d, J = 1,8 Hz, H-5′ , 6,93 1H, d, J = 8,1 Hz, H-8′ , 6,30 1H, d, J = 16,1 Hz, H-2′ , 5,85 (1H, br s, OH-7′ , 4,72 1H, d, J = 8,8 Hz, H-3), 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz, H-24), 3,94 (3H, s, OCH3-6′ , 1,68 3H, s, H3-26), 1,62 (3H, s, CH3-27), 0,98 (3H, s, CH3-29), 0,97 (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-30), 0,90 (3H, s, CH3-28), 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-21), 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH2-19), 0,38 (1H, d, J = 4,4 Hz, CH2-19).
Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 cho thấy đây là hợp chất triterpenoid có dạng khung cycloartane. Các tín hiệu của cyclopropane methylene tại δH 0,38 (1H, d, J =4,4 Hz, CH2-19) và 0,60 (1H, d, J = 4,0 Hz, CH2-19); bốn nhóm methyl bậc ba tại δH 0,98 (3H, s, CH3-29), 0,97 (3H, s, CH3-18), 0,91 (3H, s, CH3-30), 0,90 (3H, s, CH3-28); một nhóm methyl bậc hai tại δH 0,89 (3H, d, J = 6,2 Hz, CH3-21); một nhóm methylene tại δH 5,10 (1H, br t, J = 6,6 Hz,