4.3.1 Kiểm tra khả năng sinh enzyme catalase
- Do oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang độc tính đối với vi sinh
vật nên vi sinh vật cũng có khả năng tự giải độc bằng cách tạo ra những men có khả năng phá hủy một số sản phẩm chứa oxy như vậy. Điển hình của loại men này là catalase.
- Mỗi dòng lấy một ít vi khuẩn trong ống trữ và trải lên lam, sau đó nhỏ giọt
H2O2 và đọc kết quả ta thấy cả hai dòng vi khuẩn đều có catalase âm tính vì không có bọt khí xuất hiện.
4.3.2 Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease
Hình 11 Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease
Môi trường bị tan chảy
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 26
- Quá trình thủy phân protein đến acid amin là một quá trình rất phức tạp. Đặc
hiệu của enzyme là chỉ tác dụng lên một vài chất nào đó với vài kiểu liên kết nhất định, như enzyme peptidase chỉ tác dụng lên nối liên kết peptide để thủy phân nối liên kết này. Sản phẩm chủ yếu của quá trình phân giải protein là các acid amin và các peptide cấp thấp.
- Ban đầu khi các ống nghiệm cho vào môi trường lạnh đều đặc lại nhưng khi đem ra ngoài không khí cả hai dòng đều làm môi trường gelatin – pepton hóa lỏng
(dung dịch trong ống nghiệm sẽ chảy ra khi đặt nằm ngang). Như vậy cả hai dòng đều có protease dương tính, điều này có ý nghĩa trọng trong lên men cá vì nó giúp biến đổi
protein của cá thành các acid amin, làm tăng nguồn đạm dinh dưỡng cho sản phẩm.
4.3.3 Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase
Hình 12 Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase
- Cả hai dòng vi khuẩn đều không làm mất màu dung dịch iod, như vậy cả hai
dòng này có amylase âm tính.
- Theo tài liệu kỹ thuật chế biến hải sản của Phan Thị Thanh Quế (2000), thì
đường thêm vào quá trình lên men có thể là đường đơn (glucose, fructose,...) nhưng
cũng có thể sử dụng các nguồn cacbohydrate như tinh bột, gạo, nếp...Mặc dù hầu hết
vi khuẩn lactic không có khả năng tạo enzyme thủy phân tinh bột. Trong sản phẩm
mắm cá có bổ sung thêm thính (gạo rang), mục đích là làm cho sản phẩm có mùi thơm
và cũng là một nguồn Cacbon ban đầu cho vi sinh phát triển vì trong sản phẩm ngoài vi khuẩn lactic còn có thể có các vi sinh khác, góp phần phân giải nguồn cacbohydrate
này thành glucose. Chẳng hạn như nấm men chúng biến đổi nguồn glucose này thành
rượu từ đó tạo ra các hóa hợp chất mùi (ester, diacetyl, acetaldehyde...) thông qua phản ứng hóa học góp phần tạo nên hương vị đặc trưng của sản phẩm.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 27
4.3.4 Nhuộm Gram
Tiến hành nhuộm Gram, quan sát cả hai dòng vi khuẩn phân lập được là G+ vì có màu tím xanh.
Tóm lại: Cả hai dòng vi khuẩn đều được phân lập trên môi trường MRS, đều là vi
khuẩn G+, catalase âm tính, protease dương tính, amylase âm tính, như vậy có thể
khẳng định đây là vi khuẩn lactic. Dựa vào hình dạng, cũng như những đặc điểm trong
tài liệu Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol.2 (1986), có thể dòng thứ
nhất là: Lactobacillus minor có hình que ngắn với một đầu tròn thường uốn cong
phòng lên một phía, kích thước 0,6 - 0,8 x 1,5 – 2m. Dòng thứ hai có thể là
Lactobacillus curvatus hình que ngắn dính từng cặp hoặc mạch ngắn, kích thước 0,7 - 0,9 x 1 - 2m. Với những kết quả như trên thì 2 dòng vi khuẩn được sử dụng để chủng
vào sản phẩm ở thí nghiệm tiếp theo và có thể được nghiên cứu sâu hơn bằng cách dùng PCR để định danh chính xác loài của dòng vi khuẩn lactic này.
Hình 13 Nhuộm Gram dòng thứ nhất (X100)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 28
4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn lactic đến sự thay đổi
pH, acid tổng, đạm amoniac và đạm amin trong quá trình lên men 4.4.1 Sự thay đổi pH sau các ngày lên men
Bảng 8 Kết quả pH trung bình sau các ngày lên men
Ngày Mật độ 1 10 20 0 6,19a 4,83a 4,64a 105 6,18a 4,5a 4,33b 107 6,13a 4,56a 4,23b CV (%) 0,70 4,64 4,46
(Trong cùng một cột các giá trị có cùng chữ cái thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ ý nghĩa 95%) 0 1 2 3 4 5 6 7 0 5 10 15 20 25 Ngày p H A1 A2 A3
A1: 0, A2: 105, A3: 107
Hình 15 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi pH sau các ngày lên men
- Vi khuẩn lactic có thể tạo nên các hợp chất có khả năng kiềm hãm hoạt động
của lượng lớn vi sinh vật. Sự hình thành acid lactic hay acid acetic trong quá trình trao
đổi chất của vi khuẩn lactic làm giảm pH đến giới hạn nhất định có thể ngăn cản hoạt động của vi khuẩn gây hư hỏng. Việc giảm nhanh pH phụ thuộc vào nhiều yếu tố như
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 29
nhiệt độ, nồng độ muối, nguồn cabohydrate sử dụng và đặc biệt là mật độ vi khuẩn
lactic trong sản phẩm. Tuy nhiên việc khống chế pH cũng cần chú ý đến khoảng pH tối
thích cho hoạt động của các enzyme phân giải protein như enzyme trypsin và pepsin
có nhiều trong nội tạng của cá.
- Kết quả cho thấy, pH ở các nghiệm thức bắt đầu giảm nhanh ở 10 ngày đầu nhưng sau đó giảm chậm do quá trình lên men lactic xảy ra nhanh và do tác động của
muối cùng với lượng acid sinh ra theo thời gian càng làm cho vi khuẩn lactic hoạt động yếu dần. Kết quả khảo sát về sự thay đổi pH cho thấy việc bổ sung vi khuẩn làm pH thấp hơn mẫu đối chứng và ở nghiệm thức có mật độ vi khuẩn lactic lớn nhất thì pH giảm thấp nhất, như vậy mật số vi khuẩn lactic đóng vai trò quan trọng trong lên men lactic. Tuy nhiên theo kết quả xử lý thống kê thì sau 20 ngày lên men mẫu có mật
số 105 và 107 pH không có sự khác biệt chỉ khác biệt ý nghĩa với mẫu không chủng.
- Sản phẩm chủng vi khuẩn lactic lên men 20 ngày có pH tương đương với sản
phẩm lên men tự nhiên 30 đến 45 ngày. Như vậy việc chủng vi khuẩn lactic vào sản
phẩm có tác dụng rút ngắn thời gian lên men.
4.4.2 Sự thay đổi acid tổng số sau các ngày lên men (%)
Bảng 9 Kết quả acid tổng trung bình sau các ngày lên men
Ngày Mật độ 1 10 20 0 0,4a 2,66b 3,04c 105 0,49a 2,97ab 3,67b 107 0,52a 3,32a 4,5a CV (%) 16,39 10,46 17,87
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 30 0.00% 0.50% 1.00% 1.50% 2.00% 2.50% 3.00% 3.50% 4.00% 4.50% 5.00% 0 5 10 15 20 25 Ngày A c id t ổ n g ( % ) A1 A2 A3
A1: 0, A2: 105, A3: 107
Hình 16 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi acid tổng sau các ngày lên men
- Ngoài tác dụng tạo hương vị đặc trưng của sản phẩm, acid lactic còn có tác dụng như là chất bảo quản do acid có khả năng ức chế vi sinh vật gây thối . Khi vi
khuẩn lactic hoạt động càng mạnh thì quá trình lên men tạo ra acid được nhiều, khả năng ức chế vi khuẩn gây thối càng cao. Tuy nhiên khi acid tích tụ với lượng quá cao
thì các vi khuẩn lactic cũng bị ức chế. Do đó trong quá trình lên men mắm cá cần phải
tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn lactic hoạt động, ức chế được hoạt động của vi
sinh vật gây thối.
- Acid ban đầu trong sản phẩm rất thấp, sau 10 ngày lên men lượng acid tăng rất nhanh, nhưng sau 20 ngày thì lượng acid tăng lên rất ít, như vậy quá trình lên men ở
ngày thứ 20 trở đi bắt đầu chậm dần, đến giai đoạn nào đó lượng acid sinh ra ức chế lại
sự phát triển của vi khuẩn lactic làm cho quá trình lên men ngừng lại.
- Kết quả phân tích phương sai trên acid tổng cho thấy việc sử dụng tỉ lệ vi
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 31
4.4.3 Sự thay đổi đạm amoniac sau các ngày lên men (g/kg)
Bảng 10 Kết quả đạm amoniac trung bình sau các ngày lên men
Ngày Mật độ 1 10 20 0 0,49a 3,08b 4,55a 105 0,52a 3,58ab 4,06ab 107 0,38a 3,92a 3,64b CV (%) 18,16 11,9 10,26
(Trong một cột các giá trị có cùng chữ cái thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%)
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 0 5 10 15 20 25 Ngày Đ ạm am o n ia c (g /kg ) A1 A2 A3
Hình 17 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi đạm amoniac sau các ngày lên men
- Đạm amoniac còn gọi là đạm thối, sự hiện diện của loại đạm này nhiều hay ít
quyết định chất lượng của sản phẩm. Đạm amoniac được tạo thành do vi sinh vật gây
thối phân hủy protein của thịt cá. Đạm amoniac tạo thành và bốc hơi làm thất thoát đạm. Hàm lượng đạm amoniac tạo thành nhiều hay ít phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ đường, nồng độ muối, mật số vi khuẩn...
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 32
- Lượng đạm amoniac trong sản phẩm ít và cũng tăng theo thời gian, đặc biệt là
ở 10 ngày đầu lượng đạm amoniac tăng rất nhanh.Ở 10 ngày đầu lượng đạm amoniac ở mẫu đối chứng ít hơn mẫu có mật số 105 , 107 nhưng đến ngày thứ 20 thì lượng đạm
amoniac ở mẫu đối chứng lại cao hơn nhiều so với hai mẫu có chủng vi khuẩn lactic.
Điều này chứng tỏ ở mẫu có mật số vi khuẩn lactic cao sẽ ức chế lại sự phát triển của
vi sinh vật gây thối làm cho lượng đạm amoniac trong sản phẩm cũng thấp. Theo kết
quả xử lý thống kê thì sau 20 ngày lên men mẫu có chủng vi khuẩn thì đạm amoniac
có sự khác biệt so với mẫu đối chứng, nhưng giữa 2 mật số 105 và 107 thì không có sự
khác biệt nhiều.
4.4.4 Sự thay đổi đạm amin sau các ngày lên men (g/kg)
Bảng 11 Kết quả đạm amin trung bình sau các ngày lên men
Ngày Mật độ 1 10 20 0 5,85a 10,33b 11,48c 105 6,48a 12,46a 16b 107 6,06a 13,02a 18,06a CV (%) 8,76 13,43 19,78
(Trong một cột các giá trị có cùng chữ cái thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 5 10 15 20 25 Ngày Đ ạ m a m in ( g /k g ) A1 A2 A3 A1: 0, A2: 105 , A3: 107
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 33
- Đạm amin là tổng lượng đạm nằm dưới dạng acid amin (g/kg), quyết định giá
trị dinh dưỡng của mắm cá.
- Mắm chua có hàm lượng đạm từ thịt cá và nước mắm cung cấp một số acid
amin thiết yếu. Trong quá trình thủy phân enzyme có sẵn trong cá và enzyme từ nước
mắm phân giải protein trong cá thành các acid amin. Để nhận biết quá trình lên men kết thúc người ta có thể dựa vào hàm lượng đạm amin, nếu hàm lượng đạm amin
không còn tăng hoặc tăng không đáng kể thì quá trình lên men kết thúc. Trong sản
phẩm mắm chua thành phẩm nếu hàm lượng đạm amin càng cao thì càng tốt.
- Hàm lượng đạm amin tăng theo thời gian, giá trị đạm amin tăng dần từ ban đầu đến ngày 20. Do sản phẩm có nồng độ muối thấp (5%) nên lượng đạm amin sinh
ra rất cao vì ở nồng độ này thích hợp cho vi sinh vật thủy phân protein thịt cá hoạt động và hệ enzyme trong mẫu cũng hoạt động tốt nên lượng amin sinh ra cao. Theo kết quả xử lý thống kê thì 10 ngày đầu mẫu mật số 105 và 107 đạm amin không có sự
khác biệt nhưng đến ngày thứ 20 thì giữa 3 mẫu có sự khác biệt ý nghĩa.
- Tóm lại: sản phẩm có hàm lượng đạm amin cao hay thấp khi thành phẩm
quyết định chất lượng của sản phẩm lên men tốt hay không. Việc chọn nguyên liệu cá
phải tươi có cơ thịt rắn chắn thì đạm amin mới cao, việc chọn nồng độ đường, nồng độ
muối và vi khuẩn thích hợp cũng quyết định chất lượng của sản phẩm.
4.5 Thí nghiệm 5: Kết quả đánh giá cảm quan
Bảng 12 Kết quả đánh giá cảm quan sản phẩm của 12 người
1 2 3 Mẫu Mẫu Chỉ tiêu Điểm cảm quan Màu sắc 2,8b 3,5a 2,9ab Mùi 3,2b 4a 3,8ab Vị 3,2a 3,7a 3,4a Cấu trúc cơ thịt và xương 2,8b 4,2a 3,3b
Mẫu 1: 0, Mẫu 2: 105, Mẫu 3: 107
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 34 17% 58% 25% A1 A2 A3
A1: 0, A2: 105, A3: 107
Hình 19 Biểu diễn % sở thích các mẫu của các cảm quan viên
- Chất lượng sản phẩm thực phẩm không những bao hàm giá trị dinh dưỡng mà còn bao hàm cả giá trị cảm quan. Màu sắc của sản phẩm thực phẩm không chỉ có giá trị về mặt hình thức mà còn có tác dụng sinh lí, ngoài ra mùi vị của thực phẩm cũng rất
quan trọng, ảnh hưởng đến hệ tuần hoàn, hệ hô hấp, hệ tiêu hóa, khứu giác và cả vị
giác. Vì vậy trong sản xuất thực phẩm người ta nghiên cứu tìm mọi biện pháp kĩ thuật để bảo vệ những chất thơm tự nhiên và điều khiển các phản ứng tạo ra những chất thơm mới.Để thuận lợi cho mọi người thử cảm quan bố trí thêm hủ mắm từ thị trường để các cảm qua viên có cơ sở đánh giá.
- Xử lý thống kê cho thấyở các chỉ tiêu màu sắc, mùi, cấu trúc cơ thịt và xương
của mẫu 2 khác biệt ý nghĩa so với mẫu 1. Riêng đối với chỉ tiêu vị thì cả 3 mẫu không
có sự khác biệt ý nghĩa, có thể do sự phối chế gia vị ban đầu của cả 3 mẫu giống nhau, vi sinh không ảnh hưởng nhiều đến vị của sản phẩm. Điểm cảm quan của mẫu 2 và 3 không có sự khác biệt nhiều nhưng điểm cảm quan của mẫu 2 lại cao hơn mẫu 3 mặc dù lượng vi khuẩn chủng vào ít hơn.
- Nhìn chung điểm cảm quan của mẫu 2 là cao nhất và so với ý thích của cảm
quan viên thì mẫu 2 là có số lượng đông nhất, nghĩa là có màu sắc, mùi, vị và cấu trúc
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 35
Bảng 13: So sánh các chỉ tiêu hóa học giữa mẫu thí nghiệm và mẫu truyền thống
Tóm lại: Theo kết quả phân tích ở trên thì mẫu chủng vi khuẩn với mật số 107
có các chỉ tiêu hóa học gần bằng với mẫu lên men tự nhiên. Nhưng thời gian lên men tự nhiên thì dài hơn khoảng 30 đến 45 ngày mới cho ra thành phẩm, còn sản phẩm có
chủng vi khuẩn thì khoảng 20 ngày có thể sử dụng được. Như vậy việc chủng vi khuẩn
vào có tác dụng rút ngắn thời gian lên men xuống khoảng 10 đến 20 ngày. Mẫu có mật
số 107 tuy lượng đạm amin cao nhưng hàm lượng acid sinh ra cũng cao, điều này cũng ảnh hưởng đến cảm quan của sản phẩm. Có thể do đó mà điểm cảm quan của mẫu có
mật số vi khuẩn chủng vào là 105 cao hơn mẫu có mật số chủng vào là 107. Còn mẫu
có mật số 105 hàm lượng đạm amin không bằng mẫu lên men tự nhiên và đạm
amoniac cũng hơi cao hơn tuy nhiên sản phẩm không bị đắng. Vì vậy nghiệm thức với
mật số 105 được chọn là nghiệm thức tốt nhất.
Mẫu thí nghiệm sau 20 ngày lên men Chỉ tiêu Mật số: 105 Mật số: 107 Mẫu truyền thống pH 4,33 4,23 4,27 Acid lactic 3,67% 4,5% 3,19%