M ỤC LỤC
3.3.3 Phương pháp xét nghiệm
Lấy máu và chiết lấy huyết thanh chuột bạch
Lấy máu chuột bạch: máu được lấy bằng cách cắt đuôi. Sau khi tiêm truyền 7 ngày, tiến hành lấy máu cho vào ống nghiệm vô trùng và để yên ống nghiệm cho máu đông. Sau đó chiết lấy huyết thanh chuột cho vào týp nhựa và bảo quản ở nhiệt độ -200C. Cách tuần lấy máu 1 lần, lấy 7 lần
Lấy máu ngỗng
Máu ngỗng được lấy từ tĩnh mạch cánh, trước khi lấy cần phải giữ chặt ngỗng, phải sát trùng vị trí cần lấy máu.
Cách lấy máu ngỗng: dùng ống tiêm 20ml và kim tiêm 23G vô trùng, hút 1,5ml chất chống đông alsever vào ống tiêm, rút 8,5ml máu từ tĩnh mạch cánh ngỗng, rồi lắc nhẹ để trộn đều.
Rửa và bảo quản hồng cầu ngỗng
Hồng cầu ngỗng được rửa 4 lần trong dung dịch DGV, kỹ thuật làm vô trùng. Một khối lượng máu toàn phần và 2,5 khối lượng DGV, lắc nhẹ cho đều rồi ly tâm 1000 vòng/phút, trong 15 phút, hút bỏ phần nước nỗi trên.
Hòa hồng cầu với 3 khối lượng DGV, lắc nhẹ để trộn đều, ly tâm 1000 vòng/ phút trong 15 phút, bỏ phần nước trên. Rửa tiếp 2 lần với DGV (tổng cộng 4 lần rửa).
Dùng hematocrit để xác định tỷ lệ hồng cầu, sau đó pha loãng thành hồng cầu 8% trong DGV và bảo quản ở nhiệt độ 40C.
Hồng cầu sẽ được tiếp tục pha loãng trong VAD theo tỷ lệ 1/24 khi sử dụng trong phản ứng HI (hồng cầu 0,33%).
Xử lý huyết thanh
Trước khi làm phản ứng phải xử lý huyết thanh loại bỏ chất kìm hãm ngưng kết hồng cầu kết hồng cầu không đặc hiệu.
Xử lý bằng kaolin: dùng micropipet hút 0,05ml huyết thanh cho vào ống nghiệm vô trùng, cho tiếp 0,2 ml dung dịch borat pH = 9 và 0,25 ml dung dịch kaolin, lắc kỹ hỗn dịch trong 5 phút/lần trong 20 phút, ly tâm 2000 vòng/phút trong 15 phút, hút lấy phần nước trong ta được huyết thanh pha loãng 1/10.
Xử lý bằng hồng cầu: cho huyết thanh đã pha loãng 1/10 vào ống nghiệm vô trùng, cho thêm một giọt hồng cầu ngỗng đặc, lắc nhẹ cho đều, để trong nước có nước đá, cho tiếp xúc 20 phút, ly tâm 2000 vòng/phút, trong 20 phút, hút lấy phần nước trong bên trên cho vào týp nhựa vô trùng, ta được huyết thanh đã xử lý. Trữ huyết thanh ở nhiệt độ -200C.
Thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
Trước khi thực hiện phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) thì cần thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA). Mục đích: định lượng và chuẩn độ kháng nguyên virus viêm não Nhật Bản dùng cho phản ứng HI.
Thành phần phản ứng
Kháng nguyên chuẩn, chủng Nakayama pha loãng 1/10 trong dung dịch borat.
Dung dịch borat
Hồng cầu ngỗng đã pha loãng 0,33% trong dung dịch VAD
Tiến hành phản ứng
Cho vào tất cả 12 giếng của microplate 0,05ml dung dịch borat, tiếp tục cho vào giếng thứ nhất 0,05ml kháng nguyên đã pha loãng 1/10, trộn đều, hút 0,05ml sang giếng thứ 2, trộn đều, hút 0,05ml sang giếng thứ 3,… Tiếp tục như thế đến giếng thứ 12 thì bỏ đi 0,05ml. Sau đó, cho 0,05ml hồng cầu ngỗng 0,33% vào mỗi giếng, lắc đĩa nhẹ để trộn đều kháng nguyên và hồng cầu, để ở nhiệt độ phòng. 1 giờ sau đọc kết quả.
Đọc kết quả phản ứng HA
Dương tính 4+: Hồng cầu kết thành một lớp mỏng, che kín cả đáy giếng. Dương tính 3+: đại đa số hồng cầu kết thành một lớp mỏng, nhưng đáy giếng còn một ít hồng cầu không ngưng kết tụ lại thành hình nhẫn.
Dương tính 2+: đại đa số hồng cầu tụ lại ở đáy giếng thành cụm, xung quanh có một ít hồng cầu ngưng kết lấm tấm.
Âm tính: hồng cầu tụ lại thành một cụm tròn nhỏ ở đáy giếng.
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của kháng nguyên còn khả năng ngưng kết ở mức độ 4+ hay 3+ và gọi là một đơn vị ngưng kết.
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Nguyên lý: virus VNNB có khả năng gây ngưng kết hồng cầu ngỗng ở một pH nhất định. Kháng thể đặc hiệu của virus VNNB có khả năng làm mất hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
Mục đích: Định tính và định lượng kháng thể kháng virus VNNB trong huyết thanh chuột.
Thành phần phản ứng
Dung dịch BABS 0,4%. Huyết thanh đã xử lý.
Kháng nguyên có 8 đơn vị ngưng kết pha loãng trong dung dịch BABS 0,4% để ở nhiệt độ 4oC trong một giờ.
Hồng cầu ngỗng 0,33% pha trong VAD.
Tiến hành
Cho vào mỗi giếng của microplate 0,025ml dung dịch BABS 0,4%, cho tiếp 0,025ml huyết thanh đã xử lý ở giếng thứ nhất, trộn đều, hút 0,025ml cho sang giếng thứ 2, làm tiếp tục như vậy cho đến giếng thứ 12 thì bỏ đi 0,25ml. Tiếp theo cho 0,025ml kháng nguyên pha loãng trong dung dịch BABS 0,4% trữ lạnh ở 40C, lắc đều. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. Sau đó cho vào giếng 0,05ml hồng cầu ngỗng đã pha loãng 0,33% để ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 1 giờ.
Đọc kết quả sau 1 giờ
Giếng nào không xảy ra ngưng kết hồng cầu là dương tính Giếng nào có ngưng kết hồng cầu là âm tính
Hiệu giá ngăn ngưng kết hồng cầu trở ngưng kết hồng cầu của huyết thanh là độ pha loãng cuối cùng của huyết thanh có khả năng ngăn ngưng kết hồng cầu.
Có thể đọc được:
Dương tính giếng thứ 1 tương đương với hiệu giá 1/20 Dương tính giếng thứ 2 tương đương với hiệu giá 1/40 Dương tính với giếng thứ 3 tương đương với hiệu giá 1/80 ……… Âm tính: hồng cầu ngưng kết ở hiệu giá nhỏ hơn 1/20
Thực hiện phản ứng đối chứng
Đối chứng âm và dương thực hiện tương tự mẫu huyết thanh kiểm tra nhưng thay mẫu huyết thanh cần kiểm tra bằng mẫu huyết thanh âm tính và dương tính chuẩn.
Đối chứng hồng cầu: cho vào 10 giếng, mỗi giếng 0,05ml BABS 0,4%, sau đó chotiếp 0,05ml hồng cầu ngỗng 0,33%. Sau 1 giờ quan sát đối chứng hồng cầu.