Cân 2,00g (±0,1g) mẫu vào ống Falcon 50ml
Thêm 0,6 ml Buffer A và 0,4 ml Buffer B, 6,5ml ACN vào mỗi ống Falcon chứa mẫu
Lắc khoảng 30 giây, sau đó siêu âm trong bể siêu âm khoảng 10 phút Ly tâm 4000 v/p trong 10 phút ( to=20-250C)
Hút 5ml dung dịch trong cho vào ống Falcon 50ml khác Thêm 3ml H2O và 2 ml DCM vào mỗi ống nghiệm
Lắc trên máy lắc (shaker) 15 phút
Li tâm 4000v/p ở nhiệt độ phòng trong 10 phút (250C) Hút 3ml dung dịch lớp trên cho vào ống li tâm thủy tinh 12 ml
Thêm 0,1 ml dung dịch oxy hóa (oxidation) lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng 25 phút
Bay hơi dung dịch trong ống nghiệm dưới dòng khí Nitơ ở nhiệt độ 50-600C Hòa tan cặn còn lại với 1ml n-Hexan, 1,6ml đệm trích mẫu
Lắc 30 giây, li tâm 4000v/p trong 10 phút.
Hút khoảng 0,3ml dung dịch lớp dưới đem phân tích
Phát hiện tổng CV/LCV bằng kĩ thuật miễn dịch dùng enzyme liên kết (xem hướng dẫn ở mục 3.3.7.2.Phát hiện tổng CV/LCV bằng kĩ thuật miễn dịch dùng
enzyme liên kết). 3.4.4 Chuẩn bị hóa chất chất chuẩn
3.4.4.1 Đệm rửa
Trộn 1 thể tích của dung dịch đệm rửa có độ đậm đặc 20 lần (20x Wash Solution) với 19 thể tích nước cất. Dung dịch pha mới trước mỗi lần sử dụng. 3.4.4.2 Dung dịch cơ chất/ tạo màu
Dung dịch cơ chất /tạo màu đã được pha sẵn để sử dụng, nhưng kết tủa ở nhiệt độ -40C. Vì vậy cẩn thận đưa lọ này về nhiệt độ phòng sau đó lắc đều trước khi cho vào giếng.
3.4.4.3 Dung dịch đệm trích A
Dung dịch này được pha từ 2 gói thuốc thử I và II trong gói đệm trích A (Concentrate of Buffer A). Hoà tan 2 gói thuốc thử I và thuốc thử II với 100ml nước cất, bảo quản ở nhiệt độ phòng.
3.4.4.4 Dung dịch đệm trích B
Trộn 1 thể tích của dung dịch đệm trích B có độ đậm đặc 10 lần (10x Extration Buffer B ) với 19 thể tích nước cất. Dung dịch pha mới trước mỗi lần sử dụng.
3.4.4.5 Dung dịch đệm trích C
Trộn 1 thể tích của dung dịch đệm trích C có độ đậm đặc 10 lần (10x Sample Extraction Buffer C) với 9 thể tích nước cất. Dung dịch pha mới trước mỗi lần sử dụng.
3.4.4.6 Dung dịch đệm pha loãng mẫu (Đệm trích C: ACN = 4:1, v/v) Trộn 4 thể tích dung dịch đệm trích C với 1 thể tích acetonitril. 3.4.4.7 Dung dịch oxy hoá
Trộn 1 thể tích của dung dịch oxy hóa có độ đậm đặc 10 lần (10x Oxidant Solution) với 9 thể tích ACN.
3.4.4.8 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn
Chú ý: Nồng độ dung dịch hoặc lượng cân của chuẩn phải được hiệu chỉnh lại theo độ tinh khiết của chuẩn và gốc tự do của chuẩn.
- Dung dịch chuẩn gốc CV và LCV 1000µg/ml:
Cân 20mg mỗi chuẩn CV và LCV cho vào mỗi bình định mức 20 ml, thêm khoảng 10ml acetonitrile lắc đều hoặc đánh siêu âm cho đến khi hòa tan hết. Định mức tới vạch với acetonitrile. Bảo quản kín ở ≤00C, tránh ánh sáng, dung dịch ổn định 1 năm.
- Dung dịch chuẩn trung gian CV và LCV 100µg/ml:
Hút 1ml mỗi dung dịch chuẩn gốc CV, LCV 1000µg/ml cho vào từng bình định mức 10 ml và định mức đến vạch với acetonitrile, lắc đều, bảo quản kín ở ≤00C, tránh ánh sáng, dung dịch ổn định 6 tháng.
- Dung dịch chuẩn trung gian CV và LCV 10µg/ml:
Hút 1ml mỗi dung dịch chuẩn CV, LCV 100µg/ml cho vào từng bình định mức 10 ml và định mức đến vạch acetonitrile, lắc đều, bảo quản kín ở ≤00C, tránh ánh sáng, dung dịch ổn định 3 tháng.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp CV và LCV làm việc 0.1µg/ml (dùng để chuẩn bị mẫu thêm chuẩn):
Hút 0.1ml dung dịch chuẩn CV, LCV 10µg/ml cho vào cùng một bình định mức 10ml, định mức tới vạch với acetonitrile, lắc đều, bảo quản kín 2-80C, tránh ánh sáng, dung dịch ổn định trong 1 tuần.
3.4.5 Chuẩn bị mẫu 3.4.5.1Đồng hóa mẫu 3.4.5.1Đồng hóa mẫu
Lấy phần mô cơ từ những vị trí khác nhau của mẫu. Tránh những mô mỡ. Cắt phần mô vừa lấy thành từng miếng nhỏ từ 3-5 cm.
Cho phần mô vừa cắt (khoảng 100 gam) vào máy xay mẫu, xay đến khi mẫu đồng nhất.
Giữ mẫu trong túi PE hàn kín miệng ở -180C hoặc thấp hơn cho đến khi phân tích. Khi tiến hành phân tích, mẫu phải đưa về nhiệt độ phòng.
- Mẫu trắng: là mẫu đã được xác định không chứa CV/LCV và MG/LMG.
Dùng cân có d=0,01g cân 2,00 gam mẫu đã được đồng hóa vào ống ly tâm nhựa 50ml. Lượng cân chỉ được phép sai lệch ± 0,1 gam.
- Mẫu thêm chuẩn có nồng độ 0,6 µg/kg.
Cân 2,00gam (± 0,1 g) mẫu trắng đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml. Hút chính xác 12 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa CV/LCV 0,1µg/ml cho vào mẫu đã cân. Lắc kỹ khoảng 1 phút, sau đó để yên ít nhất 30 phút cho dung dịch chuẩn thấm vào mẫu.
- Mẫu thêm chuẩn có nồng độ 1 µg/kg:
Cân 2,00gam (± 0,1 g) mẫu trắng đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml. Hút chính xác 20 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa CV/LCV 0,1µg/ml cho vào mẫu đã cân. Lắc kỹ khoảng 1 phút, sau đó để yên ít nhất 30 phút cho dung dịch chuẩn thấm vào mẫu.
- Mẫu thêm chuẩn có nồng độ 2 µg/kg:
Cân 2,00gam (± 0,1 g) mẫu trắng đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml. Hút chính xác 40 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa CV/LCV 0,1µg/ml cho vào mẫu đã cân. Lắc kỹ khoảng 1 phút, sau đó để yên ít nhất 30 phút cho dung dịch chuẩn thấm vào mẫu.
- Mẫu thêm chuẩn có nồng độ 3 µg/kg:
Cân 2,00gam (± 0,1 g) mẫu trắng đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml. Hút chính xác 60 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa CV/LCV 0,1µg/ml cho vào mẫu đã cân. Lắc kỹ khoảng 1 phút, sau đó để yên ít nhất 30 phút cho dung dịch chuẩn thấm vào mẫu.
- Mẫu thêm chuẩn có nồng độ 4 µg/kg:
Cân 2,00gam (± 0,1 g) mẫu trắng đã đồng nhất cho vào ống ly tâm 50ml. Hút chính xác 80 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa CV/LCV 0,1µg/ml cho vào mẫu đã cân. Lắc kỹ khoảng 1 phút, sau đó để yên ít nhất 30 phút cho dung dịch chuẩn thấm vào mẫu.
3.4.6 Tiến hành phát hiện tổng CV/LCV bằng kĩ thuật miễn dịch dùng enzyme liên kết. enzyme liên kết.
- Lấy đủ số giếng cần thiết cho mỗi lần phân tích.
- Hút 100µl dịch trích mẫu cho vào các giếng còn lại, mỗi mẫu lặp lại hai lần.
- Thêm 50µl dung dịch thể tiếp hợp (CV-HRPO) vào tất cả các giếng. - Gói kín toàn bộ khay vi đĩa, sau đó lắc nhẹ trong 1 phút.
- Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ (20-250C) trong 1 giờ.
- Sau khi ủ xong rửa khay vi đĩa 3 lần bằng dung dịch đệm rửa.
- Hút 100µl dung dịch cơ chất tạo màu cho vào tất cả các giếng. Đem ủ trong 20 phút ở nhiệt độ 20-250C.
- Cho vào 100 µl dung dịch ngừng phản ứng ở tất cả các giếng. - Đo độ hấp thụ tại bước sóng 450 nm bằng máy đọc.
3.4.7 Đọc kết quả
Giá trị mật độ quang trung bình (OD) của hai giếng A1 and A2 là giá trị nền của các giá trị mật độ quang (OD) của mẫu và chuẩn.
3.5 Tiến hành xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
Trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp, đề tài không xác định thông số độ ổn định vì để đánh giá được thông số này cần nhiều thời gian khảo sát, theo dõi. Với thời gian thực hiện của đề tài, không đủ để đánh giá thông số này.
3.5.1 Xác định độ tuyến tính, khoảng làm việc của phương pháp
- Xác định độ tuyến tính của đường chuẩn: Tiến hành xây đựng đường chuẩn CV/LCV trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 4,5ng/ml. Các dung dịch chuẩn do nhà sản xuất kit thử cung cấp. Đường chuẩn được xây dựng vào ba ngày khác nhau. Xác định hệ số hồi quy tuyến tính (R2) của đường chuẩn vào các ngày khác nhau. Đường chuẩn CV/LCV được xem là tuyến tính khi R2 ≥ 0,99.
- Xác định khoảng làm việc của phương pháp:
Khoảng làm việc của phương pháp được xác định bằng cách nhân hệ số pha loãng của phương pháp phân tích với khoảng nồng độ tuyến tính của đường chuẩn.
Luận văn chỉ thực hiện khảo sát sự ảnh hưởng pH của dung dịch đệm trích C dùng để pha loãng mẫu đến giá trị nền mẫu và độ thu hồi của phương pháp.
Dung dịch đệm trích C được thay đổi pH từ 4,5 đến 6,5. Bước thay đổi pH cho mỗi lần khảo sát là 0,5. Ở mỗi giá trị pH khảo sát, thực hiện phân tích 3
mẫu trắng và 3 mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 4 µg/kg (Cách chuẩn bị mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn xem phần 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu, mục 3.4.5 Chuẩn bị mẫu).
Giá trị pH được chọn phải đảm bảo sao cho giá trị nhiễu nền nhỏ và độ thu hồi của phương pháp đạt từ 70 đến 130%.
3.5.3 Xác định giới hạn phát hiện CCβ
3.5.3.1 Khảo sát độ nhiễu của của nền mẫu cá tra, xác định CCα và CCβ Phân tích tối thiểu 20 mẫu trắng (xem hướng dẫn chuẩn bị mẫu ở mục 3.4.5). Xác định giá trị nhiễu nền trung bình, độ lệch chuẩn của nền mẫu, giá trị CCα và giá trị CCβ theo các công thức (1) và (2).
3.5.3.2 Thẩm tra sai số β:
Phân tích 20 mẫu trắng thêm chuẩn ở mức CCβ tính toán. Sai số β ≤ 5% (không quá 1 mẫu không phát hiện CV/LCV).
3.5.3.3 Nếu sai số β ≥ 5%, khảo sát lại giá trị thực tế của CCβ:
Lần lượt thực hiện phân tích mẫu trắng thêm chuẩn ở mức nồng độ 1,5 lần, 2,00 lần giá trị CCβ đã xác định ở bước 3. Việc phân tích được lặp lại đến khi sai số β ≤ 5% (không quá 1 mẫu không phát hiện CV/LCV).
3.5.4 Xác định độ lặp lại và độ tái lặp
Thực hiện 3 lần phân tích, mỗi lần thực hiện như sau: Thêm chuẩn vào mẫu trắng ở các mức nồng độ: 1, 2 và 3 lần giá trị CCβ thực tế. Mỗi mức nồng độ thực hiện 07 mẫu. Tổng số mẫu phân tích cho ba đợt là 63 mẫu.Tính được giá trị độ lệch chuẩn (SD) của từng nồng độ, độ lệch chuẩn nội bộ phòng (SDW/L) theo các công thức (4) và (3) (cách chuẩn bị mẫu thêm chuẩn xem hướng dẫn ở mục 3.4.5).
3.6 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu
Nồng độ CV/LCV trong mẫu được xác định theo phương pháp nội suy. Đường chuẩn được xây dựng từ giá trị mật độ quang trung bình (OD) của các dung dịch chuẩn.
Giá trị mật độ quang trung bình (OD) của hai giếng A1 and A2 là giá trị nền của các giá trị mật độ quang (OD) của mẫu và chuẩn.
Các giá trị (OD) trung bình của các chuẩn và mẫu (trung bình của hai giếng lặp lại) chia cho giá trị (OD) của chuẩn zero nhân 100.
Chuẩn zero có giá trị là 100% (độ hấp thụ cực đại) và các giá trị OD còn lại là ước số phần trăm của giá trị hấp thụ cực đại:
O.D. chuẩn (hoặc mẫu)
x 100= % độ hấp thụ cực đại O.D.chuẩn zero
Đường chuẩn:
Các giá trị độ hấp thụ được gắn tương ứng với trục Y và logarithmic nồng độ các chuẩn ứng với trục X biểu diễn trên đồ thị. Đường chuẩn phải tuyến tính trong khoảng 0,05 Đường chuẩn:
Các giá trị độ hấp thụ được gắn tương ứng với trục Y và logarithmic nồng độ các chuẩn ứng với trục X biểu diễn trên đồ thị. Đường chuẩn phải tuyến tính trong khoảng 0,05 ÷ 4,5 ng/ml.
S2 S3 S6 S5 S4 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0.01 0.1 1 10 Nồng độ (ppb) OD Hình 3.1: Đường chuẩn
Nồng độ tổng CV/LCV tính được từ đồ thị nhân cho hệ số pha loãng mẫu và chuyển đổi sang đơn vị ng/g trong mẫu mô.
Phân tích ít nhất 20 mẫu trắng/matrix, và tính độ nhiễu nền của mẫu trắng (S/N). Ba lần giá trị S/N là CCα.
Giá trị CCα được xác định theo công thức:
CCα = 3 x SD + Xtb (1)
Trong đó:
SD: Độ lệch chuẩn Xtb: Nồng độ trung bình Xác định giá trị CCβ
Giá trị CCβ được xác định theo công thức: CCβ = CCα + 1,64*SDW/L (2)
Trong đó: SDW/L là độ lệch chuẩn nội bộ phòng xác định theo công thức:
∑ ∑ = = − × − = n i i n i ri i L W n SD n SD 1 1 2 / ) 1 ( ] ) 1 [( (3) Trong đó: ni: số lần phân tích lặp lại ở nồng độ thứ i SDri: độ lệch chuẩn ở nồng độ thứ i, Độ lệch chuẩn (SD): ) 1 ( 1 2 ( − = ∑ −= n tb i n i x x SD (4) Trong đó:
xi: nồng độ mẫu phân tích được ở lần thứ i
tb
x : nồng độ trung bình của các lần phân tích. n: số lần phân tích
Độ lệch chuẩn tương đối (RSD):
tb x RSD x SD 100 = (5) Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn
tb
x : nồng độ trung bình của các lần phân tích Độ thu hồi của phương pháp
100 % x x y R= (6) Trong đó:
y là nồng độ mẫu phân tích được x là nồng độ mẫu ban đầu
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Độ đặc hiệu :
Tính đặc hiệu của kit thử sử dụng dựa trên tỉ lệ phản ứng chéo (do nhà sản xuất kit thử cung cấp qua tài liệu hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất kit thử CV/LCV, Bioo Scientific – 2010).
Phản ứng chéo với:
Crystal violet : 100%
Leuco Crystal violet (sau khi oxy hoá) : 100%
Malachit Green : 82%
Leuco Malachit Green : <0,01%
Diethylstilbestrol : <0,01%
Sulfumethazine : <0,01%
Chloramphenicol : <0,01%
Furazolidone : <0,01%
Tỉ lệ phản ứng chéo cho thấy, ngoài phản ứng với CV/LCV 100%,kit thử phản ứng với MG là 82% và một số hóa chất, kháng sinh khác, vì vậy nguồn nguyên liệu để chuẩn bị mẫu thí nghiệm phải được đảm bảo rằng không nhiễm bất kì hóa chất, kháng sinh nào, đặc biệt là MG, để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm.
4.2. Khảo sát độ tuyến tính của đường chuẩn, khoảng làm việc của kit thử Tiến hành xây dựng đường chuẩn CV/LCV trong khoảng nồng độ từ Tiến hành xây dựng đường chuẩn CV/LCV trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 4,5 ng/ml. Các dung dịch chuẩn do nhà sản xuất kit thử cung cấp.
y = -0.3057Ln(x) + 0.6935 R2 = 0.9987 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.01 0.10 1.00 10.00 Nồng độ CV/LCV Đ ộ h ấ p thu (O D)
Hình 4.1: Đồ thị đường chuẩn với nồng độ thêm vào 1 µg/kg. Qua Hình 4.1 cho thấy: Đồ thị đường chuẩn là dạng đường thẳng và dang phương trình của đồ thị là y = ax + b.
Vì đồ thị đường chuẩn là dạng đường thẳng nên cần khảo sát độ tuyến tính.
Kết quả xác định hệ số hồi quy tuyến tính của đường chuẩn (R2) được trình bày ở Bảng 4.1, các số liệu quan trắc gốc xem phụ lục 3 trang 37.
Bảng.4.1: Bảng hệ số hồi quy tuyến tính của đuờng chuẩn R2
Nồng độ thêm vào (µg/kg).
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
1,00 0,999 0,999 1,00
2,00 1,00 1,00 1,00
3,00 0,999 1,00 1,00
Kết quả khảo sát cho thấy, hệ số hồi quy tuyến tính (R2) luôn lớn hơn 0,99. Điều này chứng tỏ trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 4,5 ng/ml, đường chuẩn tuyến tính.
Hệ số pha loãng mẫu trong quá trình phân tích xác định CV/LCV là 2,0 và đường chuẩn tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0,05 đến 4,5 ng/ml. Nên kit thử có khả năng làm việc trong khoảng từ nồng độ từ 0,10 đến 9 µg/kg.
4.3 Ruggedness: (Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân tích): Tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của pH dung dịch đệm trích C đến độ Tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của pH dung dịch đệm trích C đến độ nhiễu nền của mẫu và độ thu hồi của phương pháp. Kết quả khảo sát được trình bày ở Bảng 4.2