mầm giống DT2008 và ĐT26
Nồng độ kanamycin được sử dụng cho nghiên cứu chọn lọc mô tế bào mang gen thường dao động từ 50-500 mg/l tùy thuộc vào loài thực vật và loại mô tế bào sử dụng trong thí nghiệm. Với cây đậu tương non, Zhang và cs (2006) sử dụng nồng độ kanamycin cao 400 mg/l để chọn lọc cá thể chuyển gen. Cũng trên cây đậu tương nhưng với vật liệu lá mầm Muhammad và cs (2010) lại sử dụng nồng độkanamycin thấp trong khoảng từ 20-50 mg/l trong quá trình tiến hành chọn lọc. Nhằm xác định liều lượng kanamycin thích hợp giúp ức chế hoàn toàn sự tái sinh của các mô tế bào đậu tương không mang gen kháng, chúng tôi bố trí thí nghiệm bổ sung kanamycin ở các nồng độ khác nhau vào môi trường tái sinh của giống DT2008 và ĐT26. Dưới đây là kết quả thí nghiệm chúng tôi thu được sau 40 ngày thí nghiệm. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của kháng sinh kanamycin đến khả năng tái sinh của mẫu lá mầm giống
đậu tương DT2008 và ĐT26 Công Tỉ lệ thức mẫu chết (%) 1 0 2 60 3 96 4 100
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.10 cho thấy, ngưỡng nồng độ kanamycin thích hợp để ức chế sự phát triển của mô không mang gen ngoại lai của cả hai giống đậu tương thí nghiệm là 50-75 mg/l. Qua các thí nghiệm đã tiến hành, chúng tôi xác minh được nồng độ kháng sinh kanamycin thích hợp để chọn lọc mô mang gen là 50-75 mg/l. Ở khoảng nồng độ này, 96- 100% mẫu lá mầm của giống đậu tương ĐT26 và 92-100% mẫu lá mầm của giống đậu tương
DT2008 không mang gen kháng mất khả năng tái sinh.
Từ các kết quả đạt đƣợc chúng tôi đƣa ra quy trình chuyển gen nhƣ sau:
Khử trùng hạt Cho hạt nảy mầm Làm tổn thương nốt lá
mầm của hạt
Chủng vi khuẩn C58C1
Nuôi lỏng tạo huyền phù
Cho mẫu đậu tương tiếp xúc với dịch khuẩn với OD600 = 0,8 (lây nhiễm trong 60 phút) Đồng nuôi cấy trên môi trường A2 (trong 5 ngày)
Khử khuẩn bằng cefotaxim (250 mg/l) và vancomycim (250 mg/l)
Chọn lọc bằng Kanamycin (50 mg/l)
Tạo chồi trên môi trường MS-B5 + 0,1mg/l IBA + 2mg/l BAP (trong 9 tuần)
Kéo dài chồi trên môi trường MS-B5 +0,5 mg/l α-NAA(trong 4 tuần)
Ra rễ trên môi trường MS-B5 +0,5 mg/l α- NAA(trong 4 tuần)
Sơ đồ quy trình quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ CP4-EPSPS vào hai giống đậu tương DT2008 và ĐT26