Đây là vi khuẩn được tìm thấy lần đầu tiên vào năm 1920 [32]. Năm 1986, vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus stearothermophilus [27,44]. Năm 2001, nhóm các nhà khoa học từ Moscow [70] đã bắt đầu phân tích các hệ sinh thái vi sinh vật của các mỏ dầu ở nhiệt độ cao ở Kazakhstan. Sau khi phun nước nóng từ biển Caspian để thay thế nước ban đầu, các nhà khoa học phát hiện ra rằng có sự gia tăng vi sinh vật và đa dạng sinh trưởng. Nguồn nước nóng, mặn và nước oxy hóa đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của vi khuẩn ưa khí, ưa nhiệt và hình thành nội bào tử của thermophiles. Sau khi phân tích các đặc điểm di truyền và sinh lý, các nhà khoa học xác định chỉ một phần thuộc vi khuẩn Bacillus stearothermophilus. Sau khi kiểm tra kỹ lưỡng các loại vi khuẩn dựa trên đặc điểm về hình thái, sinh lý học, và phát sinh loài, họ thấy nó thuộc một đơn vị phân loại riêng biệt là Geobacillus. Vi khuẩn này đã chính thức đổi tên Geobacillus stearothermophilus vào năm 2004 [67].
G. stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đã được phân lập từ một số địa điểm quan trọng tại Hoa Kỳ như: trên gỗ mục nát ở Florida, đất đã được sử dụng kỹ thuật làm giàu và suối nước nóng ở công viên Quốc gia Yellowstone. Những địa điểm này thể hiện đặc điểm của nó là một vi khuẩn khử nitơ, có khả năng sinh trưởng trong các môi trường nóng khác nhau và có tên là
Geobacillus mà chữ “Geo” có nghĩa là trái đất [70].
1.5.1.1. Phân loại:
Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus thuộc: [70]
Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Chi: Geobacillus Loài: G. stearothermophilus
Hình 1.8. Cây phát sinh dựa trên sự sắp xếp gen 16S rRNA [70]
1.5.1.2. Đặc điểm của Geobacillus stearothermophilus:
Vi khuẩn G. stearothermophilus được phân bố rộng rãi trong các môi trường ấm như: đất, cát sa mạc, vùng biển và suối nước nóng. G. stearothermophilus là trực khuẩn ưa nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Về mặt lâm sàng, vi khuẩn này cũng có vai trò quan trọng trong việc chứng minh rằng quá trình khử trùng phòng thí nghiệm đang hoạt động đúng tiến trình [60]. Cả hai chỉ số sinh học và hóa học được sử dụng để xác định sự hiện diện của bào tử G. stearothermophilus trên bề mặt đã trải qua một quá trình khử trùng [59,70]. Vi khuẩn này cũng được sử dụng như là một chỉ số sinh học để chứng minh độ sạch của các sông suối, cũng như nguồn chính cung cấp các enzyme chịu nhiệt được sử dụng trong các ứng dụng công nghiệp [70]. G. stearothermophilus còn có ý nghĩa trong việc xác minh các thực phẩm bị hư hỏng, chủ yếu là sữa và sữa chua [36,43].
Geobacillus stearothermophilus là vi khuẩn Gram dương, hình que, có thể sinh trưởng đơn lẻ hoặc chuỗi, có khả năng tạo thành bào tử, có thể tạo thành nội bào tử khi môi trường dinh dưỡng bị suy giảm. Thành tế bào của vi khuẩn có cấu trúc của
vi khuẩn Gram dương điển hình. Chúng có cấu tạo gồm một lớp peptidoglycan dày xung quanh màng sinh chất [67]. Lớp peptidoglycan này chứa DAP hoặc axit meso- diaminopimelic và có chứa lượng axit teichoic đáng kể với axit muramic giúp bảo vệ thành tế bào trong suốt quá trình phân chia. [70]
Bề mặt của vi khuẩn này có chứa một lớp vỏ, lớp S-layer, các protein. Các lớp này kết tinh trên bề mặt các protein giống như các lớp S-layer của các vi khuẩn khác, chúng có mối liên quan chặt chẽ với các tế bào của vi khuẩn [67].
Đặc điểm sinh hóa
G. stearothermophilus có phản ứng catalase và oxidase dương. Vi khuẩn này sử dụng hoàn toàn các hợp chất hữu cơ đơn giản như đường, axit amin, axit hữu cơ và oxy là chất nhận điện tử cuối cùng [67,70]. G. stearothermophilus cũng là vi khuẩn khử nitơ. Vi khuẩn được tìm thấy trong đất công nghiệp và phân compost và nó tham gia vào quá trình khử nitơ trong phân bón từ NO3 xuống NO2 dễ bay hơi hoặc N2 [70].
Đặc điểm nuôi cấy
- Điều kiện sinh trưởng: Vi khuẩn này có khả năng di động, hiếu khí. G.
stearothermophilus sinh trưởng ở nhiệt độ khác nhau, từ 30-75oC, chịu axit với dải pH từ 2-11 và nhiệt độ tăng trưởng tối ưu ở 50-65°C. Đặc biệt loài vi khuẩn này có thể sống sót ở nhiệt độ cao đến 130oC [59]. Vi khuẩn dễ dàng sinh trưởng và phân lập trong phòng thí nghiệm vi sinh [70]. G. stearothermophilus là chủng vi khuẩn rất dễ bị ức chế bởi kháng sinh, đặc biệt là nhóm β-lactam [54,61,66,45].
- Đặc điểm nuôi cấy:
Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB):
vi khuẩn sinh trưởng làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan khi lắc đều.
- Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác. Vi khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như Glucose) và nitơ (như Peptone).
Hình 1.9. Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus trên môi trường thạch [31] 1.5.1.3. Sự hình thành bào tử ở vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:
Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử G.stearothermophilus có chứa một lượng lớn canxi, magie và acid dipicolinic.
Bào tử G. stearothermophilus là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần và có thêm một số thành phần mới. Bào tử được bọc trong một vỏ dày gồm nhiều lớp:
- Lớp màng ngoài: Màng ngoài nằm ở ngoài cùng, đó là các phần còn sót lại của tế bào mẹ, có khi có khi không, khi dày, khi xốp, chiếm 2 - 10% khối lượng khô của bào tử. Màng ngoài gồm 2 lớp, lớp ngoài dày 6nm, lớp trong dày
19nm.
- Lớp áo bào tử: Lớp áo bào tử là một lớp peptidoglycan dày trong đó gồm nhiều loại protein khác nhau. Lớp áo bào tử thường chứa các protein lắp ráp và các yếu tố hình thái quan trọng. Lớp áo này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của bào tử.
- Lớp vỏ bào tử: Vỏ bào tử chiếm thể tích rất lớn (36 - 60%). Lớp này có vai trò như một lớp rào cản và là nguồn gốc kháng nguyên bề mặt của bào tử. Lớp vỏ bào tử có phản ứng với lectin để tạo liên kết với các olysaccharide nằm trong các sợi trên lớp vỏ bào tử.
- Lõi bào tử: còn gọi là thể chất nguyên sinh của bào tử. Lõi gồm 4 phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất và vùng nhân.
1. Áo bào tử 2. Lớp màng ngoài 3. Vỏ bào tử 4. Vách tế bào 5. Lớp màng trong 6. Lõi bào tử
Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau: 1. Hình thành những búi chất nhiễm sắc.
2. Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền bào tử.
3. Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ.
4. Lớp vỏ sơ khai hình thành giữa hai lớp màng của bào tử sau khi đã tích lũy nhiều peptioglican và tổng hợp dipicolinat canxi, tính chiết quang tăng cao.
5. Kết thúc việc hình thành áo bào tử.
6. Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử. Bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt.
7. Nang bào vỡ ra, bào tử thoát ra ngoài.
Hình 1.12. Quá trình hình thành bào tử
Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc và
tạo thành tiền bào tử (prospore). Tiền bào tử dần được bao bọc bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử.
- Sự nảy mầm của bào tử: Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn được gọi là quá trình nảy mầm của bào tử. Quá trình này gồm 3 giai đoạn: hoạt hóa, nẩy mầm và sinh trưởng.
Protein có chứa nhiều systein trong áo bào tử hoá xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến sự hoạt động của enzyme proteinaza. Khi đó lượng protein trong áo bào tử giảm xuống. Các cation bên ngoài có thể xâm nhập vào lớp vỏ bào tử và làm trương lớp vỏ lên, sau đó làm tan ra và tiêu thoái đi. Khi đó nước bên ngoài sẽ xâm nhập vào lớp lõi bào tử làm cho lõi trương to lên, các loại enzyme bắt đầu được hoạt hoá lên, bắt đầu quá trình tổng hợp thành tế bào.
Trong quá trình nảy mầm các đặc tính chịu nhiệt, chiết quang cao… bắt đầu giảm dần, lượng BPA - Ca, acid amin, polipeptit dần dần mất đi, bắt đầu xảy ra việc tổng hợp ADN, ARN và protein trong lõi bào tử. Bào tử chuyển sang thành tế bào dinh dưỡng. Khi nảy mầm, bào tử mầm có thể đâm ra theo phía cực hoặc đâm ngang ra. Lúc đó thành tế bào còn rất mỏng và chưa hoàn chỉnh do đó nâng cao khả năng tiếp nhận thêm ADN ngoại lai để thực hiện quá trình biến nạp. Cuối cùng, bào tử chứa một số enzyme sửa chữa ADN, ADN sẽ được sửa chữa trong quá trình nảy mầm và tăng trưởng sau khi lõi đã được hoạt hóa trở lại.
Sức đề kháng của bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus:
Bào tử có sức đề kháng cao với các yếu tố vật lý và hóa học như nhiệt độ, tia cực tím, áp suất và chất sát trùng. Bào tử có sức đề kháng cao và sống lâu là do:
- Nước trong bào tử phần lớn ở trạng thái liên kết, do đó không có khả năng làm biến tính protein khi tăng nhiệt độ.
- Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca2+ và acid dipicolinic, protein của bào tử kết hợp với dipicolinate canxi thành một phức chất có tính chất ổn định cao đối với nhiệt độ.
- Các enzyme và các hoạt chất sinh học khác chứa trong bào tử đều tồn tại dưới dạng không hoạt động, hạn chế sự trao đổi chất của bào tử đối với tế bào bên ngoài.
- Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc và tính ít thẩm thấu của các lớp màng làm cho các tính chất hóa học và chất sát trùng khó có thể tác động tới bào tử.