3. Nội dung nghiên cứu
2.3.7. Phương pháp đọc trình tự
Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, trình tự đoạn gen CYP79D1 được xác định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABIPRISM@3100 Genetic Analyzer (Applied Biosytem) tại Viện Công nghệ Sinh học.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết RNA, tạo cDNA và nhân đoạn gen CYP97D1
Mẫu sắn sau khi thu thập được tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng kit được mô tả ở phần 2.3.1 - Chương 2.
Hình 3.1. Kết quảtách chiết RNA tổng số KM94: sắn KM94; XVP: sắn Xanh Vĩnh Phú
Kết quả tách chiết RNA tổng số cho thấy mẫu RNA đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao.
Sau khi tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA, quá trình nhân bản đoạn gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R. Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3. Chương 2.
Hình 3.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1từ RNA tổng số 1-5: sắn KM94; 6-10: sắn Xanh Vĩnh Phú; M: Marker 1kb
Trên điện di đồ (hình 3.2) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có kích thước khoảng 0,5kb. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.
3.2. Kết quả tách chiết DNA và nhân đoạn gen CYP97D1
Song song với quá trình nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số, chúng tôi còn tiến hành nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ DNA tổng số. DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp được mô tả trong phần 2.3.1 - Chương 2.
Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số
1. Sắn KM942. Sắn xanh Vĩnh Phú
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy ở cả 2 mẫu đều xuất hiện 1 băng sáng, rõ chứng tỏ chúng tôi đã tách được DNA tổng số của các giống sắn với độ nguyên vẹn đảm bảo cho nhân bản đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR tiếp theo (Hình 3.3).
Sau khi tách chiết thành công DNA tổng số, quá trình nhân bản đoạn gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R. Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3 Chương 2.
Hình 3.4. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1
Trên điện di đồ (Hình 3.4) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có kích thước khoảng 1 kb. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.
3.3. Xác định và phân tích trình tự đoạn gen CYP79D1 của 2 giống sắn Xanh Vĩnh Phú và KM94
Do sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide...còn dư và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình xác định trình tự nucleotide. Chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 2 mẫu sắn theo Kit GenJET DNA Purification. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra chất lượng và giải trình tự gen.
Xác định trình tự nucleotide
Sau khi giải trình tự, các đoạn gen CYP79D1 được xử lý bằng chương trình BLAST trên NCBI và phần mềm BioEdit. Các trình tự đoạn gen
CYP79D1 của giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM-94 được chúng tôi so sánh với trình tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 trên GenBank.
Sau khi xác định trình tự nucleotide và phân tích bằng các phần mềm, kết quả cho thấy đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú được tách chiết từ RNA đều có kích thước là 669 bp, gen CYP79D1 được tách chiết từ DNA có kích thước là 999 bp. Tiếp theo, chúng tôi so sánh trình tự gen
CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự gen AF140613.
So sánh trình tự đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự có mã số AF140613 trên Genbank
Trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 có kích thước là 1629 bp. Trình tự gen AF140613 phân lập từ cDNA do vậy trình tự gen này chỉ gồm các đoạn exon. Kết quả so sánh cho thấy, các đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94
và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng với gen AF140613 là 99%. Cặp mồi mà chúng tôi thiết kế để nhân bản đoạn gen CYP79D1 nằm từ nucleotide 674 tới nucleotide 1342 của trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613. Đây là vùng bảo thủ trong họ gen này đảm bảo cho quá trình làm câm lặng gen sau này.
Khi so sánh về trình tự nucleotide đoạn gen CYP79D1 của 2 giống Sắn Xanh Vĩnh Phú và sắn KM94 được tách từ DNA với gen có mã số AF140613 chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G thành nucleotide A). Tuy nhiên trong đoạn trình tự chúng tôi có 2 vùng exon và xen kẽ là 1 vùng intron, vùng intron nằm ở vị trí từ 345 đến 675. Do vậy sự tương đồng giữa 2 đoạn gen này với gen có mã số AF140613 chia làm 2 vùng như mô tả hình 3.5.
Hình 3.5. So sánh bằng đồ họa vềtrình tự đoạn genCYP79D1
Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số với trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 trên Genbank cho thấy các đoạn gen
CYP79D1 của giống sắn KM-94 và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng là 99%, giữa các trình tự có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G thành nucleotide A) và ở vị trí nucleotide thứ 130 (từ nuceotide G thành nuceotide A).
Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ DNA với trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau: ở trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số không có đoạn intron như khi phân lập từ DNA.
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 CAAGAGATACTTCGGCAAGGGAATGCCGGACGGAGGACCAGGGCCTGAAGAAATCGAGCA KM94-RNA ............................................................ ----
---
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
....|....
AF140613_CYP79D1 CATTGATGCCGTTTTCACTGCCTTGAAATACTTGTATGGGTTTTGCATATCAGATTTCTT KM94-RNA...................
Xanh Vinh Phu-RNA ...................
KM94- DNA...................
Xanh Vinh Phu-DNA ...................
....|....
AF140613_CYP79D1 GCCTTTCTTGTTGGGACTTGATCTGGATGGCCAAGAAAAATTTGTGCTTGATGCAAATAA KM94-RNA.........
Xanh Vinh Phu-RNA .........
KM94- DNA.........
Xanh Vinh Phu-DNA .........
....|....
AF140613_CYP79D1 GACCATAAGGGATTATCAGAACCCTTTAATTGATGAAAGGATTCAACAATGGAAGAGTGG KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 TGAAAGGAAGGAAATGGAGGACTTGCTTGATGTTTTCATCACTCTCAAGGATTCAGACGG KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
AF140613_CYP79D1 CAACCCATTGCTCACTCCTGACGAGATCAAGAATCAAATAGCTG KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
AF140613_CYP79D1 KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
AF140613_CYP79D1 KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
AF140613_CYP79D1 KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
AF140613_CYP79D1 KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
AF140613_CYP79D1 KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
AF140613_CYP79D1 GGCAATGGGGGAGATGCTAAATCAACCAGAAATCCTGAAGAAGGCCACAGAAGAGCTCGA
KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
AF140613_CYP79D1 CAGGGTGGTCGGCAAAGACAGGCTTGTTCAAGAATCCGACATCCCCAACCTTGACTATGT KM94-RNA
Xanh Vinh Phu-RNA KM94- DNA
Xanh Vinh Phu-DNA
AF140613_CYP79D1 CAAAGCCTGTGCAAGAGAAGCCTTCAGGCTCCATCCAGTAGCACACTTCAATGTCCCTCA
KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
910 920 930 940 950 960
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
AF140613_CYP79D1 TGTAGCCATGGAAGACACTGTCATTGGTGATTACTTTATTCCAAAGGGCAGCTGGGCAGT KM94-RNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................
KM94- DNA ............................................................
Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................
970 980 990 ....|....|....|....|....|....|....|....
AF140613_CYP79D1 TCTCAGCCGCTATGGGCTCGGCAGGAACCCAAAGACATG KM94-RNA .......................................
Xanh Vinh Phu-RNA .......................................
KM94- DNA .......................................
Xanh Vinh Phu-DNA .......................................
Dựa trên trình tự của gen CYP79D1 và CYP79D2 của họ cytochrome P450, chúng tôi sử dụng thuật toán Blast để xác định toàn bộ vị trí các gen CYP79D1 và
CYP79D2 trên cơ sở dữ liệu của sắn. Khi tìm kiếm gen CYP79 ở sắn trên cơ sở dữ liệu của sắn, chúng tôi nhận thấy gen CYP79D1 nằm trên nhiễm sắc thể 13 có mã định danh là cassava4.1_005059m nằm ở locus Manes.13G094200, CYP79D2 nằm trên nhiễm sắc thể 12 có mã định danh là cassava4.1_005079m nằm ở locus Manes_12G133500. Ngoài ra, chúng tôi còn tìm thấy gen CYP84A1 nằm trên nhiễm sắc thể 4 có mã định danh là cassava4.1_024692m nằm ở locus Manes.04G084200, gen CYP81D1 nằm trên nhiễm sắc thể 5 có mã định danh là cassava4.1_024196m nằm ở locus Manes.05G178600, gen CYP93A2 nằm trên nhiễm sắc thể 7 có mã định danh là cassava4.1_027206m nằm ở locus Manes.07G003300 (hình 3.6)
Hình 3.6. Vị trí phân bố của một số gen CYP trên hệ gen sắn
1. Kết luận
Đã tách chiết được DNA tổng số và khuếch đại thành công đoạn gen
CYP79D1 bằng kỹ thuật PCRởcác mẫu sắn xanh Vĩnh Phú và KM94.
Đã tách chiết được RNA tổng số và khuếch đại thành công đoạn gen
CYP79D1 bằng kỹ thuật PCRởcác mẫu sắn xanh Vĩnh Phú và KM94.
Đã phân lập thành công và xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen
CYP79D1 từ DNA của giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM-94. Đoạn gen
CYP79D1 thu được cókích thước 999 bp, bao gồm 2 vùng exon và 1 vùng intron.
Đã phân lập thành công và xác định được trình tự nucleotide của đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số của giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM- 94.Đoạn gen CYP79D1 thu được có kích thước 669 bp.
2. Đề nghị
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đặt tiền đề cho việc tiếp tục nghiên cứu ứng dụng đoạn gen này trong kỹ thuật RNAi nhằm làm giảm hàm lượng HCN trong sắn tại Việt Nam. Đề nghị tiếp tục nghiên cứu trình tự các đoạn gen liên quan đến quá trình tổng hợp hydrogen cyanide ở cây sắn và một số loài thực vật có chứa chất trên.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Xích Liên (2004), Tinh bột sắn và các sản phẩm từ tinh bột sắn , Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội.
2. Hoàng Kim, Trần Ngọc Ngoạn, Nguyễn Thị Trúc Mai, Võ Văn Quang, Nguyễn Bạch Mai, Nguyễn Thị Lệ Dung, Nguyễn Phương, Hoàng Long, Nguyễn Minh Cường, Đào Trọng Tuấn, Trần Công Khanh, Nguyễn Minh Hiếu, Nguyễn Văn Bộ, Nguyễn Thị Cách, Nguyễn Trọng Hiển, Lê Huy Ham, H. Ceballos and M. Ishitani. (2014a), Kết quả chọn tạo và phát triển giống sắn mới KM419, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Hội đồng Giống Quốc gia, Hà Nội ngày 16 tháng 11 năm 2014.
3. Hoàng Kim (2013), Cây Lương thực Việt Nam (lúa, ngô, sắn, khoai lang), Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, 279 trang.
4. Hoàng Kim, Nguyễn Đăng Mãi (2001), Sắn Việt Nam: Hiện trạng, định hướng vàgiải pháp phát triển những năm đầu thế kỷ 21, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 5. Đinh Thế Lộc, Võ Nguyên Quyền, Bùi Thế Hùng, Nguyễn Thế Hùng (1997),
Giáotrình Cây lương thực, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 121- 134.
TIẾNG ANH
6. FAO/WHO (1993), Cyanogenic glycosides. In “Toxicological evaluation of certain food additives and naturally occurring toxicants”. Geneva, World Health Organization, 39th Meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (WHO Food Additives Series 30).
7. Halstrom F, Moller KO (1945), “The content of cyanide in human organs from cases of poisoning with cyanide taken by mouth; with a contribution to the toxicology of cyanides”, Acta Pharmacol Toxicol (Copenh), 1(1), pp. 18-28.
8. Heuberger C (2005), Cyanide Content of Cassava and Fermented Products with Focus on Attiéké and Attiéké Garba, Swiss Federal Institute of Technology, Zurich, Switzerland.
9. IPCS (2004), Hydrogen cyanide and cyanides: human health aspects,
Geneva, World Health Organization, International Programme on Chemical Safety (Concise International Chemical Assessment Document No. 61).
10. Joey Kwok (2008), Cyanide Poisoning and Cassava, Food Safety Focus (19). 11. Jorgensen K., Bak S., Busk PK., Sorensen C., Olsen CE., Puonti-Kaerlas J.,
Moller BL. (2005a), Cassava plants with a depleted cyanogenic glucoside content in leaves and tubers: distribution of cyanogenic glucosides, their site of synthesis and transport, and blockage of the biosynthesis by RNA interference technology, Plant Physiol, 139, pp. 363-374.
12. Hoang Kim, Nguyen Van Bo, Hoang Long, Nguyen Trong Hien, H. Ceballos
and R. Howeler (2010), “Current situation of cassava in Vietnam”, A New Future for Cassava in Asia: Its Use as Food, Feed and Fuel to Benefit the Poor, Proc. 8th Regional Workshop, held in Vientiane, Lao PDR. Oct 20-24, 2008, pp. 100-112.
13. Kirsten A.N., Olsen CE., Pontoppidan K., Møller BL (2002), Leucine- Derived Cyano Glucosides in Barley, Plant Physiol., 129 (3): 1066-1075
14. Li H.Q. (1996), Genetic transformation of cassava (Manihot esculenta Crantz), Nature Biotech., 14: 736-740.
15. Mette Dahl Andersen (1999), “Cytochromes P-450 from Cassava (Manihot esculenta Crantz) - Catalyzing the First Steps in the Biosynthesis of the Cyanogenic Glucosides Linamarin and Lotaustralin”, The journal of biological chemistry, 275 (3), pp 1966 - 1975.
16. M.P.Cereda, M.C.Y.Mattos (1996), Linamarin - the toxic compound of cassava, Journal of Venomous Animals and Toxins, 2(1).
17. Narayanan N. Narayanan, Uzoma Ihemere, Claire Ellery, Richard T. Sayre (2011), Overexpression of Hydroxynitrile Lyase in Cassava Roots Elevates Protein and Free Amino Acids while Reducing Residual Cyanogen Levels, PloS one., 6(7): e21996.
18. Nartey F (1980), Toxicological aspects of cyanogenesis in tropical foods, In: Smith RL, Bababumni ER, eds. Toxicology in the tropics. London, Taylor & Francis, 53-73.
19. Padmaja G (1995), Cyanide detoxification in cassava for food and feed uses,
Crit Rev Food Sci Nutr; 35(4), pp. 299-339.
20. Seigler DS (1991), Cyanide and cyanogenic glycosides. In “Herbivores: their
interactions with secondary plant metabolites”. (Eds GA Rosenthal, MR Berenbaum), pp. 35-77.
21. Takos AM, Knudsen C, Lai D, Kannangara R, Mikkelsen L, Motawia MS, Olsen CE, Sato S, Tabata S, Jørgensen K, Møller BL, Rook F (2011), Genomic clustering of cyanogenic glucoside biosynthetic genes aids their id entificationin Lotus japonicus and suggests the repeated evolution of
this chemical defencepathway, Plant J., 68(2), pp. 273-86
22. Y.P.Abrol, A.Ahmad (2003), Sulphur in Plants, 147-149; Mikkelsen MD, Halkier BA., Metabolic engineering of valine- and isoleucine-derived glucosinolates in Arabidopsis expressing CYP79D2 from Cassava, Plant Physiol. 2003 Feb;131(2):773-9
TÀI LIỆU THAM KHẢO KHÁC
23. Độc tố HCN trong sản phẩm sắn, http://lib.dntu.edu.vn:8080/dspace/bitstream/DNTU_123456789/1140/2/Gia
o%20trinh%20doc%20to%20trong%20thuc%20an%20chan%20nuoi%20% 202.pdf
24. Giá trị dinh dưỡng của sắn, http://iasvn.org/chuyen-muc/Gia-tri-dinh-duong- cua-San-4488.html, 29.10.2016.
25.https://vi.wikipedia.org/wiki/S%E1%BA%AFn#Ngu%E1%BB%93n_g%E1
%BB%91c,_l%E1%BB%8Bch_s%E1%BB%AD
26. Tổng cục Thống kê (2017), http://www.gso.gov.vn