Phương pháp PCR - Nội dung nghiên cứu

3. Nội dung nghiên cứu

2.3.4. Phương pháp PCR

Đoạn gen CYP79D1 được khuyếch đại bằng cặp mồi ME. Cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 và trình tự như sau:

ME-F: 5’-CAAGAGATACTTCGGCAAGG-3’ ME-R: 5’-ACCATGTCTTTGGGTTCCTG-3’ Nồng độ các thành phần và chu trình nhiệt như sau:

Bảng 2.1. Thành phần phảnứng PCR

STT Thành phần

1 Nước khử ion

2 GoTaq Green Master Mix

3 ME–F

Tổng thể tích Bước 1 2 3 4 5 6 Sản phẩm được lưu trữ ở 4 oC. 2.3.5. Phương pháp điện di sản phẩm PCR

Điện di sản phẩm PCR khoảng 30 phút trên gel agarose 1% ở 110V trong dung dịch đệm TAE 1X. Gel sau khi điện di được nhuộm với ethidium bromide nồng độ 0,5mg/ml trong 5 phút, rửa sạch, sau đó soi dưới đèn UV có bước sóng 320 nm và chụp ảnh.

2.3.6. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification gồm các bước sau:

(1) Bổ sung Binding buffer vào sản phẩm PCR theo tỉ lệ 1 : 1 về thể tích.

(2) Chuyển sang cột lọc, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút ở 4oC, loại bỏ dịch.

(3) Bổ sung 700 µl Washing buffer, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút.

(4) Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml, mở nắp 3 phút cho bay cồn. (5) Bổ sung 25µl nước khử ion, để 5 phút, li tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch đáy.

(6) Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% trong TAE 1X có marker chuẩn và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Bảo quản sản phẩm trong tủ -20oC.

2.3.7. Phương pháp đọc trình tự

Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR, trình tự đoạn gen CYP79D1 được xác định trên thiết bị giải trình tự nucleotide tự động ABIPRISM@3100 Genetic Analyzer (Applied Biosytem) tại Viện Công nghệ Sinh học.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết RNA, tạo cDNA và nhân đoạn gen CYP97D1

Mẫu sắn sau khi thu thập được tiến hành tách chiết RNA tổng số bằng kit được mô tả ở phần 2.3.1 - Chương 2.

Hình 3.1. Kết quảtách chiết RNA tổng số KM94: sắn KM94; XVP: sắn Xanh Vĩnh Phú

Kết quả tách chiết RNA tổng số cho thấy mẫu RNA đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao.

Sau khi tách chiết RNA tổng số và tạo cDNA, quá trình nhân bản đoạn gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R. Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3. Chương 2.

Hình 3.2. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1từ RNA tổng số 1-5: sắn KM94; 6-10: sắn Xanh Vĩnh Phú; M: Marker 1kb

Trên điện di đồ (hình 3.2) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có kích thước khoảng 0,5kb. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với tính toán lý thuyết. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.

3.2. Kết quả tách chiết DNA và nhân đoạn gen CYP97D1

Song song với quá trình nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ RNA tổng số, chúng tôi còn tiến hành nhân bản đoạn gen CYP79D1 từ DNA tổng số. DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp được mô tả trong phần 2.3.1 - Chương 2.

Hình 3.3. Kết quả điện di DNA tổng số

1. Sắn KM942. Sắn xanh Vĩnh Phú

Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy ở cả 2 mẫu đều xuất hiện 1 băng sáng, rõ chứng tỏ chúng tôi đã tách được DNA tổng số của các giống sắn với độ nguyên vẹn đảm bảo cho nhân bản đoạn DNA bằng kĩ thuật PCR tiếp theo (Hình 3.3).

Sau khi tách chiết thành công DNA tổng số, quá trình nhân bản đoạn gen mã hóa CYP79D1 được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu ME-F và ME-R. Thành phần và chu trình nhiệt như trình bày trong phần 2.3.3 Chương 2.

Hình 3.4. Kết quả PCR nhân đoạn gen CYP79D1

Trên điện di đồ (Hình 3.4) cho thấy sản phẩm PCR ở các mẫu sắn đều có kích thước khoảng 1 kb. Các băng đều sáng, đậm, rõ nét và không có sản phẩm phụ.

3.3. Xác định và phân tích trình tự đoạn gen CYP79D1 của 2 giống sắn Xanh Vĩnh Phú và KM94

Do sản phẩm PCR thu được sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất như mồi, đệm PCR, các nucleotide...còn dư và đôi khi có thể chứa các sản phẩm phụ sẽ ảnh hưởng đến kết quả của quá trình xác định trình tự nucleotide. Chúng tôi đã tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR của 2 mẫu sắn theo Kit GenJET DNA Purification. Các đoạn gen sau khi tinh sạch được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra chất lượng và giải trình tự gen.

Xác định trình tự nucleotide

Sau khi giải trình tự, các đoạn gen CYP79D1 được xử lý bằng chương trình BLAST trên NCBI và phần mềm BioEdit. Các trình tự đoạn gen

CYP79D1 của giống sắn xanh Vĩnh Phú và giống sắn KM-94 được chúng tôi so sánh với trình tự gen CYP79D1 có mã số AF140613 trên GenBank.

Sau khi xác định trình tự nucleotide và phân tích bằng các phần mềm, kết quả cho thấy đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú được tách chiết từ RNA đều có kích thước là 669 bp, gen CYP79D1 được tách chiết từ DNA có kích thước là 999 bp. Tiếp theo, chúng tôi so sánh trình tự gen

CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự gen AF140613.

So sánh trình tự đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94 và sắn xanh Vĩnh Phú với trình tự có mã số AF140613 trên Genbank

Trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 có kích thước là 1629 bp. Trình tự gen AF140613 phân lập từ cDNA do vậy trình tự gen này chỉ gồm các đoạn exon. Kết quả so sánh cho thấy, các đoạn gen CYP79D1 của giống sắn KM-94

và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng với gen AF140613 là 99%. Cặp mồi mà chúng tôi thiết kế để nhân bản đoạn gen CYP79D1 nằm từ nucleotide 674 tới nucleotide 1342 của trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613. Đây là vùng bảo thủ trong họ gen này đảm bảo cho quá trình làm câm lặng gen sau này.

Khi so sánh về trình tự nucleotide đoạn gen CYP79D1 của 2 giống Sắn Xanh Vĩnh Phú và sắn KM94 được tách từ DNA với gen có mã số AF140613 chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G thành nucleotide A). Tuy nhiên trong đoạn trình tự chúng tôi có 2 vùng exon và xen kẽ là 1 vùng intron, vùng intron nằm ở vị trí từ 345 đến 675. Do vậy sự tương đồng giữa 2 đoạn gen này với gen có mã số AF140613 chia làm 2 vùng như mô tả hình 3.5.

Hình 3.5. So sánh bằng đồ họa vềtrình tự đoạn genCYP79D1

Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số với trình tự gen CYP79D1 mã số AF140613 trên Genbank cho thấy các đoạn gen

CYP79D1 của giống sắn KM-94 và giống sắn xanh Vĩnh Phú có mức độ tương đồng là 99%, giữa các trình tự có sự khác nhau ở vị trí nucleotide thứ 100 (từ nucleotide G thành nucleotide A) và ở vị trí nucleotide thứ 130 (từ nuceotide G thành nuceotide A).

Khi so sánh trình tự nucleotide được phân lập từ DNA với trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số chúng tôi nhận thấy có sự khác nhau: ở trình tự nucleotide được phân lập từ RNA tổng số không có đoạn intron như khi phân lập từ DNA.

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 CAAGAGATACTTCGGCAAGGGAATGCCGGACGGAGGACCAGGGCCTGAAGAAATCGAGCA KM94-RNA ............................................................ ----

---

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

....|....

AF140613_CYP79D1 CATTGATGCCGTTTTCACTGCCTTGAAATACTTGTATGGGTTTTGCATATCAGATTTCTT KM94-RNA...................

Xanh Vinh Phu-RNA ...................

KM94- DNA...................

Xanh Vinh Phu-DNA ...................

....|....

AF140613_CYP79D1 GCCTTTCTTGTTGGGACTTGATCTGGATGGCCAAGAAAAATTTGTGCTTGATGCAAATAA KM94-RNA.........

Xanh Vinh Phu-RNA .........

KM94- DNA.........

Xanh Vinh Phu-DNA .........

....|....

AF140613_CYP79D1 GACCATAAGGGATTATCAGAACCCTTTAATTGATGAAAGGATTCAACAATGGAAGAGTGG KM94-RNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-DNA ............................................................

250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

AF140613_CYP79D1 TGAAAGGAAGGAAATGGAGGACTTGCTTGATGTTTTCATCACTCTCAAGGATTCAGACGG KM94-RNA ............................................................

Xanh Vinh Phu-RNA ............................................................

KM94- DNA ............................................................

AF140613_CYP79D1 CAACCCATTGCTCACTCCTGACGAGATCAAGAATCAAATAGCTG KM94-RNA