Phương pháp nghiên cứu

3. Nội dung nghiên cứu

2.2.Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu mẫu

Mẫu quýt BS-LS được thu thập vào giai đoạn ra lộc tháng 7 tháng 8. Cây để thu mẫu là cây khỏe mạnh, được trồng ở nơi có cường độ ánh sáng vừa đủ, thu hoạch lá non để tiến hành tách DNA. Mẫu sau thu được đựng vào túi gắn phiếu ghi đầy đủ tên mẫu, thời gian và địa điểm thu mẫu bằng loại bút không nhòe. Mẫu mang về có thể xử lý phân tích ngay hoặc bảo quản ở -20oC.

2.2.2. Phương pháp xác định trình tự gen

2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Tách chiết, tinh sạch DNA tổng số theo phương pháp CTAB do Gawel và cs đưa ra năm 1991, quy trình tách chiết được tóm tắt như sau:

1) Nghiền nhanh mẫu trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ thành bột mịn, cho vào ống eppendorf.

2) Thêm 700µl dung dịch đệm CTAB đảo trộn đều bằng máy vortex, ủ ở

65oC trong 1 giờ bằng máy lắc ổn nhiệt, cứ 10 phút lấy ra đảo nhẹ.

3) Sau 1 giờ lấy ống eppendorf chứa mẫu ra, bổ sung 700µl CIAA, đảo đều.

4) Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu 500 µl dịch nổi cho vào ống 1,5ml đã khử DEPC

5) Bổ sung 500µl isopropanol lạnh, đảo đều 15 phút ở nhiệt độ thường. Để tủ âm 20oC trong 2 giờ.

6) Ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ toàn bộ phần dung dịch,

thu cặn.

7) Bổ sung cồn 70o, đảo trộn, ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ cồn, thu tủa.

8) Làm khô DNA bằng cách mở nắp ống eppendorf trong box vô trùng

9) Hòa tan DNA trong nước khử ion vô trùng và bảo quản trong tủ âm 20oC.

2.2.2.2. Phân lập gen bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu

Gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase được phân lập bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự của gen GDP-D mã số HQ224946, Xiao - Y.Y. (2011) [22].

Cặp mồi được thiết kế có trình tự nucleotide là:

GDP-D-F: 5’-GTCCCTAAGCCACTTGTTGAATTTGC-3’ GDP-D- R: 5’-AGAAACCTGGAAGAACCATCGCGA-3’

Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.1, 2.2. Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D STT 1 2 3 4 5 6 7

Bảng 2.2. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR

Bước

1 Biến tính

2 Biến tính

3 Gắn mồi

4 Kéo dài chuỗi

5 Hoàn tất kéo dài

6 Kết thúc phản ứng

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X , nhuộm bằng Ethidium bromide (1µg/ml) với sự có mặt của thang DNA chuẩn 1 kb và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím.

Sản phẩm PCR được tinh sạch (thôi gel) theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas.

2.2.2.4. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng

Sản phẩm PCR nhân gen GDP-D sau khi được làm sạch được gắn trực tiếp vào vector pBT nhờ enzyme nối T4 ligase. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT được trình bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen GDP-Dvào vector tách dòng pBT

STT 1 2 3 4 5 Tổng thể tích Hỗn hợp trên được ủ ở nhiệt độ là 22oC trong 3 giờ và sau đó được biến

nạp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α.

2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5

Tế bào khả biến được lấy từ tủ -80oC chuyển sang môi trường -4oC. Sau 30 phút biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt.

Bổ sung 15µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến E.coli DH5α và trộn nhẹ. Hỗn hợp trên được để trong bình đá 10 phút, sau đó ủ ở 42oC (trong 1 phút 30 giây). Sau đó chuyển nhanh vào đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 500µl LB lỏng (trypton, cao nấm men, NaCl) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ.

Cấy trải

Sau khi nuôi phục hồi, ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch nổi giữ lại 150-250µl, trộn nhẹ.

Sử dụng que cấy đã khử trùng cấy trải 150 - 250µl dịch khuẩn trên môi trường LB đặc (Trypton, cao nấm men, NaCl và agar) có bổ sung kháng sinh carbenicilin (100mg/l), IPTG (0,1mM) và X - gal (40mg/l). Nuôi qua đêm ở 37o trong 16 giờ.

Chuyển khuẩn lạc sang pha nuôi lỏng

Chọn khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trường LB lỏng (có bổ sung carbenicilin 100mg/l) nuôi ở 37oC trong khoảng 3 giờ.

Chọn dòng và kiểm tra sản phẩm chọn dòng

Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc màu trắng và kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng kĩ thuật colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GDP-D. Thành phần phản ứng colony-PCR được thể hiện ở bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony- PCR STT 1 2 3 4 5 Tổng thể tích Chu trình nhiệt được đặt như sau: 95oC trong 2 phút; lặp lại 35 chu kỳ

với nhiệt độ là: 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 40 giây; sau đó để ở 72oC trong 5 phút và lưu giữ ở 8oC.

Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong Ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

Tách plasmid

Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn dòng, tiến hành tách plasmid từ các dòng khuẩn lạc dương tính với PCR bằng bộ kit Plasmid Extraction Kit. Kiểm tra sản

phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

2.2.2.6. Phương pháp xác định trình tự gen GDP-D

Trình tự của gen được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.

2.3. Phương pháp xử lý số liệu

Dữ liệu gen GDP-D được xử lý bằng các phần mềm Tin sinh học. Phần mềm BLAST trên NCBI sử dụng trong so sánh mức độ tương đồng nhằm khẳng định gen GDP-D đã phân lập. Phần mềm BioEdit sử dụng trong so sánh trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn. Phần mềm DNAstar sử dụng trong phân tích đa dạng di truyền dựa trên trình tự nucleotide của gen GDP-D.

2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm -Đại học Thái Nguyên.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nhân bản và giải trình tự gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS

3.1.1. Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR

Cặp mồi GDP-D-F/GDP-D-R được thiết kế dựa trên trình tự đoạn mã hóa của gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.

Giống quýt BS-LS có chất lượng quả tốt, sinh trưởng khỏe được sử dụng làm đối tượng phân lập gen GDP-D. Tiến hành thu mẫu mô vùng sinh trưởng của ngọn cây để phục vụ thí nghiệm tách chiết DNA. DNA tổng số được tách chiết, gen

GDP-D được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi GDP-D-F/GDP-D-R và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.

~1kb

0,75kb →

Hình 3.1. Hình ảnh điện di sảnphẩm PCR từDNA tổng số của mẫuquýt BS-LS với cặp mồi GDP-D-F và GDP-D-R; 1: mẫu BS-LS; M: thang chuẩn

DNA 1kb

Kết quả thu được ở hình 3.1 cho thấy, mẫu quýt BS-LS cho sản phẩm PCR là một băng DNA với kích thước ước tính khoảng 1 kb, phù hợp theo tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá

khẳng định chính xác sản phẩm thu được là gen GDP-D chúng tôi tiến hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide và so sánh với trình tự GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.

Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas và nhân dòng bằng PCR để thu lượng sản phẩm đủ lớn phục vụ giải trình tự nucleotide.

3.1.2. Kết quả tách dòng gen GDP-D

Sản phẩm PCR kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và được tiến hành tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT rồi biến nạp vào tế bào khả biến

E.coli DH5α bằng sốc nhiệt (42oC trong 1 phút 30 giây). Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc màu trắng với cặp mồi đặc hiệu.

Chọn ngẫu nhiên ở đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen GDP-D phân lập từ mẫu BS-LS 4 khuẩn lạc màu trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR. Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong Ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. Kết quả cho thấy, tất cả 4 dòng khuẩn lạc được kiểm tra đều dương tính với phản ứng PCR.

Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR đã được chọn để tách plasmid tái tổ hợp và đem đi giải trình tự. Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong Ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

~1kb

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc

3.1.3. Đặc điểm của trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS

Kết quả xác định trình tự gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động được trình bày ở hình 3.3.

Hình 3.3: Đặc điểm trình tự nucleotide của mẫu BS-LS thu được bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động

Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từgiống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D trên GenBank mang mã số HQ224946

Kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit cho thấy, trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G. Tỷ lệ A+T= 53,19%; G+C= 46,81%.

So sánh trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D mã số HQ224946 trên GenBank sử dụng thiết kế mồi trên hình 3.4 cho thấy có 1083 vị trí nucleotide giống nhau, chỉ sai khác ở 3 vị trí nucleotide, đó là các vị trí 370, 371, 984 (Bảng 3.1).

Bảng 3.1. Những vịtrí nucleotide sai khác giữa hai trình tựnucleotide của gen

GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946

TT

1 2 3

Ngoài ra, bằng BLAST trong NCBI cho thấy trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng so với trình tự gen GDP-D mang mã số HQ224946 sử dụng để thiết kế cặp mồi PCR là 99%. Bên cạnh đó, trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS còn có tỷ lệ tương đồng với một số trình tự khác mang mã số XM 025101133, XM 006486355, XM 006435547 là 95%; FJ643600 là 87%; XM021440285, XM021440284 là 85% (Hình 3.5).

Hình 3.5. Kết quảphân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide củagen

GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tự gen đã công bố trên

GenBank

Như vậy, chúng tôi đã tách dòng thành công và giải trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn với chiều dài 1083bp trong đó 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G.

Tiếp tục so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và với protein suy diễn từ trình tự gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank bằng phần mềm BioEdit được thể hiện ở hình 3.6. Kết quả cho thấy, protein do gen GDP-D mã hóa đều có 361 amino acid. So với protein suy diễn từ trình tự gen mang mã số HQ224946 trên GenBank thì trình tự amino acid của mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng là

99%. Tuy nhiên, các trình tự amnio acid của protein GDP-D cũng có sự khác nhau ở 2 amino acid (Bảng 3.2).

Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từgen GDP-Dphân lậptừ

giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.

Bảng 3.2. Những vịtrí amino acid sai khác giữa hai trình tựprotein suy diễn của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946

TT

1 2

Từ hình 3.6 và bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn của gen

GDP-D giữa giống quýt BS-LS và trình tự protein suy diễn của gen GDP-D đã

công bố trên GenBank mang mã số HQ224946 có 358 vị trí amino acid giống nhau, chỉ khác ở 2 vị trí acid amin, đó là các vị trí 124, 328.

3.2. Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D

Tiến hành so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS với 7 trình tự gen GDP-D đã công bố trên GenBank để xác định hệ số tương đồng và hệ số sai khác của các trình tự gen GDP-D, đồng thời thiết lập sơ đồ hình cây để phân tích sự đa dạng của các mẫu quýt thông qua trình tự gen GDP-D.

Bảng 3.3. Trình tựgen mang mã sốtrên GenBankđược sử dụng phân tích

TT Giống / Mã số trên GenBank 1 XM_025101133 2 XM_006486355 3 FJ643600 4 XM_006435547 5 XM_024064261 6 XM_021440284 7 XM_021440285

Các trình tự gen được sử dụng để so sánh có 7 mẫu (mang mã số XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284, XM_021440285, XM_024064261, FJ643600) và 1 mẫu BS-LS. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh dao động từ 69,0% đến 99,5%; còn hệ số sai khác từ 0,0% đến 40,1%.

Bảng 3.4. Hệ số tương đồng vàhệsốphân ly của trình tự nucleotide của gen

GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tự trên GenBank

Mối quan hệ di truyền của 8 mẫu quýt trên cơ sở phân tích gen GDP-D được thể hiện ở sơ đồ hình cây trên hình 3.7.

Hình 3.7. Sơ đồhình cây mô tả mối quan hệcủa BS-LS với các trình tự đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự nucleotide của gen GDP-D

Sơ đồ hình cây (Hình 3.7) dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D cho thấy, 8 mẫu được phân thành hai nhóm chính, nhóm I gồm 7 mẫu chia thành hai nhóm phụ, nhóm phụ 1 gồm 6 mẫu: XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284, XM_021440285, BS-LS; nhóm phụ 2 gồm 1 mẫu là XM_024064261. Nhóm phụ 1 lại chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm nhỏ 1 gồm 4 mẫu là XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, BS-LS; nhóm nhỏ 2 gồm 2 mẫu XM_021440284,

XM_021440285; nhóm nhỏ 1 chia thành 2 nhánh: nhánh 1 gồm 3 mẫu: XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355; nhánh 2 gồm 1 mẫu BS- LS; nhánh 1 chia thành 2 nhánh nhỏ: nhánh nhỏ 1 gồm 2 mẫu: XM_006435547, XM_006486355; nhánh nhỏ 2 gồm 1 mẫu XM_025101133. Nhóm II gồm 1 mẫu là FJ643600. Như vậy, mẫu quýt BS-LS mà chúng tôi nghiên cứu thuộc nhóm chính I.

Tiếp tục phân tích mối quan hệ của 8 mẫu dựa trên trình tự amino acid suy diễn, kết quả thể hiện ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Hệ số tương đồng vàhệsốphân ly của BS-LS và các trình tự trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D

Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh dao động từ 94,8% đến 99,9%; còn hệ số sai khác từ 0,0% đến 3,1%.

Hình 3.8. Sơ đồhình cây mô tả mối quan hệcủa BS-LS với các trình tự đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D

Khoảng cách di truyền được tính trên cơ sở so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D giữa 2 nhóm là 30.5% (Hình 3.7), còn dựa trên trình tự amino