3. Nội dung nghiên cứu
2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn
Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Luận văn được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm -Đại học Thái Nguyên.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nhân bản và giải trình tự gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS
3.1.1. Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR
Cặp mồi GDP-D-F/GDP-D-R được thiết kế dựa trên trình tự đoạn mã hóa của gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.
Giống quýt BS-LS có chất lượng quả tốt, sinh trưởng khỏe được sử dụng làm đối tượng phân lập gen GDP-D. Tiến hành thu mẫu mô vùng sinh trưởng của ngọn cây để phục vụ thí nghiệm tách chiết DNA. DNA tổng số được tách chiết, gen
GDP-D được nhân bản bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi GDP-D-F/GDP-D-R và sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
~1kb
0,75kb →
Hình 3.1. Hình ảnh điện di sảnphẩm PCR từDNA tổng số của mẫuquýt BS-LS với cặp mồi GDP-D-F và GDP-D-R; 1: mẫu BS-LS; M: thang chuẩn
DNA 1kb
Kết quả thu được ở hình 3.1 cho thấy, mẫu quýt BS-LS cho sản phẩm PCR là một băng DNA với kích thước ước tính khoảng 1 kb, phù hợp theo tính toán lý thuyết khi thiết kế mồi và tương ứng với kích thước của đoạn mã hoá
khẳng định chính xác sản phẩm thu được là gen GDP-D chúng tôi tiến hành tách dòng, xác định trình tự nucleotide và so sánh với trình tự GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas và nhân dòng bằng PCR để thu lượng sản phẩm đủ lớn phục vụ giải trình tự nucleotide.
3.1.2. Kết quả tách dòng gen GDP-D
Sản phẩm PCR kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và được tiến hành tinh sạch được gắn vào vector tách dòng pBT rồi biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α bằng sốc nhiệt (42oC trong 1 phút 30 giây). Tiến hành chọn dòng bằng phản ứng colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc màu trắng với cặp mồi đặc hiệu.
Chọn ngẫu nhiên ở đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chứa vector tái tổ hợp mang đoạn gen GDP-D phân lập từ mẫu BS-LS 4 khuẩn lạc màu trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR. Sản phẩm colony-PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong Ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím. Kết quả cho thấy, tất cả 4 dòng khuẩn lạc được kiểm tra đều dương tính với phản ứng PCR.
Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR đã được chọn để tách plasmid tái tổ hợp và đem đi giải trình tự. Sản phẩm tách plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 % trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong Ethidium bromid 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.
~1kb
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc
3.1.3. Đặc điểm của trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS
Kết quả xác định trình tự gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động được trình bày ở hình 3.3.
Hình 3.3: Đặc điểm trình tự nucleotide của mẫu BS-LS thu được bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từgiống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D trên GenBank mang mã số HQ224946
Kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit cho thấy, trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G. Tỷ lệ A+T= 53,19%; G+C= 46,81%.
So sánh trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D mã số HQ224946 trên GenBank sử dụng thiết kế mồi trên hình 3.4 cho thấy có 1083 vị trí nucleotide giống nhau, chỉ sai khác ở 3 vị trí nucleotide, đó là các vị trí 370, 371, 984 (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Những vịtrí nucleotide sai khác giữa hai trình tựnucleotide của gen
GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946
TT
1 2 3
Ngoài ra, bằng BLAST trong NCBI cho thấy trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng so với trình tự gen GDP-D mang mã số HQ224946 sử dụng để thiết kế cặp mồi PCR là 99%. Bên cạnh đó, trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS còn có tỷ lệ tương đồng với một số trình tự khác mang mã số XM 025101133, XM 006486355, XM 006435547 là 95%; FJ643600 là 87%; XM021440285, XM021440284 là 85% (Hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quảphân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide củagen
GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tự gen đã công bố trên
GenBank
Như vậy, chúng tôi đã tách dòng thành công và giải trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS thu thập tại Bắc Sơn- Lạng Sơn với chiều dài 1083bp trong đó 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G.
Tiếp tục so sánh trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và với protein suy diễn từ trình tự gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank bằng phần mềm BioEdit được thể hiện ở hình 3.6. Kết quả cho thấy, protein do gen GDP-D mã hóa đều có 361 amino acid. So với protein suy diễn từ trình tự gen mang mã số HQ224946 trên GenBank thì trình tự amino acid của mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng là
99%. Tuy nhiên, các trình tự amnio acid của protein GDP-D cũng có sự khác nhau ở 2 amino acid (Bảng 3.2).
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từgen GDP-Dphân lậptừ
giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank.
Bảng 3.2. Những vịtrí amino acid sai khác giữa hai trình tựprotein suy diễn của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946
TT
1 2
Từ hình 3.6 và bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn của gen
GDP-D giữa giống quýt BS-LS và trình tự protein suy diễn của gen GDP-D đã
công bố trên GenBank mang mã số HQ224946 có 358 vị trí amino acid giống nhau, chỉ khác ở 2 vị trí acid amin, đó là các vị trí 124, 328.
3.2. Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D
Tiến hành so sánh trình tự nucleotide gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS với 7 trình tự gen GDP-D đã công bố trên GenBank để xác định hệ số tương đồng và hệ số sai khác của các trình tự gen GDP-D, đồng thời thiết lập sơ đồ hình cây để phân tích sự đa dạng của các mẫu quýt thông qua trình tự gen GDP-D.
Bảng 3.3. Trình tựgen mang mã sốtrên GenBankđược sử dụng phân tích
TT Giống / Mã số trên GenBank 1 XM_025101133 2 XM_006486355 3 FJ643600 4 XM_006435547 5 XM_024064261 6 XM_021440284 7 XM_021440285
Các trình tự gen được sử dụng để so sánh có 7 mẫu (mang mã số XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284, XM_021440285, XM_024064261, FJ643600) và 1 mẫu BS-LS. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh dao động từ 69,0% đến 99,5%; còn hệ số sai khác từ 0,0% đến 40,1%.
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng vàhệsốphân ly của trình tự nucleotide của gen
GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tự trên GenBank
Mối quan hệ di truyền của 8 mẫu quýt trên cơ sở phân tích gen GDP-D được thể hiện ở sơ đồ hình cây trên hình 3.7.
Hình 3.7. Sơ đồhình cây mô tả mối quan hệcủa BS-LS với các trình tự đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự nucleotide của gen GDP-D
Sơ đồ hình cây (Hình 3.7) dựa trên kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D cho thấy, 8 mẫu được phân thành hai nhóm chính, nhóm I gồm 7 mẫu chia thành hai nhóm phụ, nhóm phụ 1 gồm 6 mẫu: XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284, XM_021440285, BS-LS; nhóm phụ 2 gồm 1 mẫu là XM_024064261. Nhóm phụ 1 lại chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm nhỏ 1 gồm 4 mẫu là XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, BS-LS; nhóm nhỏ 2 gồm 2 mẫu XM_021440284,
XM_021440285; nhóm nhỏ 1 chia thành 2 nhánh: nhánh 1 gồm 3 mẫu: XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355; nhánh 2 gồm 1 mẫu BS- LS; nhánh 1 chia thành 2 nhánh nhỏ: nhánh nhỏ 1 gồm 2 mẫu: XM_006435547, XM_006486355; nhánh nhỏ 2 gồm 1 mẫu XM_025101133. Nhóm II gồm 1 mẫu là FJ643600. Như vậy, mẫu quýt BS-LS mà chúng tôi nghiên cứu thuộc nhóm chính I.
Tiếp tục phân tích mối quan hệ của 8 mẫu dựa trên trình tự amino acid suy diễn, kết quả thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hệ số tương đồng vàhệsốphân ly của BS-LS và các trình tự trên
GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, hệ số tương đồng giữa các cặp so sánh dao động từ 94,8% đến 99,9%; còn hệ số sai khác từ 0,0% đến 3,1%.
Hình 3.8. Sơ đồhình cây mô tả mối quan hệcủa BS-LS với các trình tự đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D
Khoảng cách di truyền được tính trên cơ sở so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D giữa 2 nhóm là 30.5% (Hình 3.7), còn dựa trên trình tự amino acid thì khoảng cách di truyền giữa các nhóm là 1,4% (Hình 3.8). Kết quả phân tích này cho thấy các trình tự nucleotide của gen GDP-D ở các mẫu quýt khác nhau tương đối nhiều, chúng mã hóa nhiều amino acid khác nhau, dẫn tới tổng hợp các enzyme GDP-D có chức năng xúc tác khác nhau. Vì vậy, khả năng tổng hợp vitamin C ở các mẫu cũng khác nhau.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1 Gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS đã được nhân bản thành công bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu GDP-F/GDP-R có kích thước 1083bp.
1.2 Trình tự gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G. Tỷ lệ A+T= 53,19%; G+C= 46,81%.
1.3 Trình tự nucleotide của gen GDP-D của giống quýt BS-LS tương đồng với trình tự nucleotide của gen GDP-D mang mã số HQ224946 là 99% và tương đồng trình tự mang mã số FJ643600 là 87,3%.
1.4 Trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D của giống quýt BS-LS giống trình tự amino acid của protein mang mã số ADV59923 (do HQ224946 mã hóa) là 99% và giống protein mang mã số ACN38266 (do FJ643600 mã hóa) là 95,9%.
1.5 Hệ số tương đồng của trình tự gen GDP-D ở mẫu quýt nghiên cứu so với 7 mẫu trên GenBank dao động từ 69,0% đến 99,5%, hệ số sai khác là 0,1% đến 4,7%. Hệ số tương đồng về trình tự amino acid suy diễn của 8 mẫu so sánh dao động từ 98,4% đến 99,9%.
2. Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu trình tự đoạn mã hóa gen GDP-D làm cơ sở cho việc thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc GDP-D phục vụ chuyển gen để cải thiện hàm lượng vitamin C ở cây quýt.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt
1. Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi và kỹ thuật trồng, Nxb Lao
động - Xã hội.
2. Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn và Nguyễn Văn Được (2004), “Đa dạng sinh học giống cây có múi ở huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang”, Tạp chí Khoa học, số 1: 111-121.
3. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại
trong chọn giống cây trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên.
4. Trần Đình Long (1997), Chọn giống cây trồng, Nxb Nông nghiệp.
5. Hoàng Trọng Phán (2008), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Đại học Huế.
6. Hoàng Thị Sản (2004), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục.
7. Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen, Nhà xuất bản khoa học kĩ thuật.
8. Nguyễn Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật.
9. Lê Duy Thành (2003), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Nông nghiệp.
10. Quyền Đình Thi (2005), Những kỹ thuật cơ bản trong phân tích DNA, Nhà xuất Bản Khoa học và Kỹ thuật.
11. Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (2000), Phân loại học thực vật, Nxb
ĐHQGHN.
12. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tố kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2003), Công nghệ Enzym, Nxb Khoa học và Kỹ thuật.
13. Nguyễn Văn Uyển, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật,
Tập 1 (1995), Tập 2 (1996), Nxb Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh.
14. Đào Thanh Vân, Ngô Xuân Bình (2003), Giáo trình cây ăn quả (Giáo trình Sau đại học), Nxb Nông nghiệp.
II. Tài liệu tiếng Anh
16. Mohd Anwar Ahmad, Rashmi Gaur (2012) “Comparative biochemical and RAPD analysis in two varieties of rice (Oryza sativa) under arsenic stress by using various biomarkers”, Journal of Hazardous Materials, Volumes 217- 218, Pages 141-148.
17. Sadaf Altaf, Muhammad M. K. (2014), “Morphogenetic characterization of
seeded and seedless varieties of Kinnow Mandarin (Citrus reticulata Blanco)”, Australian Jounal of Crop Science (AJCS, (11): 1542-1549.
18. Goh Pik Seah ELCY , Mansor Clyde MAHANI, Yong-Jin PARK, Normah Mohd NOOR (2011), “Simple Sequence Repeat (SSR) profiling of ultivated Limau Madu (Citrus reticulata Blanco) in Malaysia”, Biotechnol. Fac. Sci. Technol., Univ.Kebangsaan Malaysia, 43600UKM Bangi, Selangor, Malaysia, Fruits, 67-74. DOI:10.1051/fruits/2011070.
19. Kinley Dorji, Chinawat Yapwattanaphun (2015), “Assessment of the genetic variability amongst mandarin (Citrus reticulata Blanco) accessions in Bhutan using AFLP marker”, BMC Genetics, 16:39 DOI 0.1186/s12863- 015-0198-8.
20. Behrouz Golein, M Nazeryan, B Babakhani (2012), “Assessing genetic variability in male sterile and low fertile citrus cultivars utilizing simple sequence repeat markers (SSRs)”, African Journal of Biotechnology, 11(7), 1632-1638.
21. Nicholas Smirnoff, Glen L.Wheeler (2000), “Ascorbic Acid in Plants Biosynthesis and Functio”, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular
Biology. UK, 291-314.
22. Xiao-Yan Yang Jin-Xia Xie, Fang-Fang Wang, Jing Zhong, Yong-Zhong Liu, Shu-Ang Peng (2011), “Comparison of ascorbate metabolism in fruits of
two citrus species with obvious difference in ascorbate content in pulp”,
Journal of Plant Physiology, 168 (02) 2196-2205.
23. Junjie Tao, Han Wu, Zhangyun Li, Chunhui Huang and Xiaobiao Xu (2018) “Molecular Evolution of GDP-D-Mannose Epimerase (GME), a Key
Gene in Plant DOI: [10.3389/fpls.2018.01293] 24.Gilbert F, Bouchet R, Causse
mannose 3,5-epimerase (GME) plays a key role at the intersection of ascorbate and non-cellulosic cell-wall biosynthesis in tomato”, Plant J, 60(3):499-508,
DOI: 10.1111/j.1365-313X.2009.03972.
III. Trang web tham khảo
25. https://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C 26.http://khoahoc.tv/tim-ra-bi-an-cua-co-che-tong-hop-vitamin-c-o-thuc-vat- 15341 27.http://thegioicaygiong.vn/san-pham/giong-cay-quyt-ngot.html/ 28.http://www.hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-va-doi-song/hoa-thuc- pham/239-vitamin-c.html 29. http://suckhoedoisong.vn/vo-quyt-vi-thuoc-da-nang-n115235.html
