Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân l- 123docz.net

Hợp chất stipuleanosid R2 sau khi phân lập được kiểm tra độ tinh khiết bằng

SKLM Silicagel RP-18 F254S trên cùng một bản mỏng, triển khai với hệ dung môi

Methanol : H2O = 2 : 1, thu được sắc ký đồ như hình 3.3.

Hình 3.3. Sắc ký đồ của hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun

TT H2SO4 10% /EtOH

Phân đoạn BuOH

(21,7 g)

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập hợp stipuleanosid R2 từphân đoạn n-butanol

Stipuleanosid R2 Bột màu trắng, 180 mg SKC pha đảo C18 (Φ50 mm × 350 mm) MeOH - H2O B4 5,1 g B1 840 mg B2 4,3 g B3 3,7 g Sắc ký cột Silica gel (Φ85 mm × 80 mm) CH2Cl2 - MeOH (5:1 0:1, v/v, 600 mL)

Nhận xét: Sau khi phun thuốc thử, SKĐ của hợp chất stipuleanosid R2 thấy

xuất hiện duy nhất vết màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang màu tím đặc trưng

cho các dẫn xuất triterpen có hệ số Rf là 0,4. Vì vậy sơ bộ kết luận chất phân lập

được là chất tinh khiết. Ngoài ra để xác định độ tinh khiết của stipuleanosid R2

phân lập được chúng tôi còn sử dụng phương pháp chuẩn hóa diện tích bằng HPLC

được trình bày ở mục3.3.2.

3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2 3.2.1. Đặc điểm cảm quan

Đặc điểm cảm quan của đối tượng nghiên cứu được quan sát bằng mắt

thường dưới ánh sáng ban ngày: bột màu trắng.

3.2.2. Điểm chảy

Tiến hành đo điểm chảy theo DĐVN V (PL-168, phương pháp 1 – phương pháp đo trong mao quản). Thu được kết quả là:

Bảng 3.2. Kết quảđo điểm chảy của stipuleanosid R2

Lần đo Kết quả (oC) Điểm chảy lý thuyết (oC)

1 213,5 210-215 2 211,6 3 212,1 Trung bình 212,4 ± 1 3.2.3. Kết quả đo phổ Góc quay cực: [α] = +7,5 (c 0,2, MeOH)

Phổ ESI-MS: m/z 1087 [M-H]- tươngứng với khối lượng phân tử là M = 1088

Phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz), DEPT: xem

bảng 3.3 Bảng 3.3. Số liệu phổ1H và 13C-NMR, DEPT của hợp chất stipuleanosid R2 Vị trí C * δC δCa,b DEPT δH a,c (độ bội, J=Hz) Aglycon 1 39,8 39,8 CH2 2 26,9 27,0 CH2 3 90,7 90,8 CH 4 40,1 40,7 C

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 20 5 57,0 57,0 CH 6 19,3 19,3 CH2 7 33,9 34,0 CH2 8 40,7 40,2 C 9 49,1 49,2 CH 10 37,8 37,9 C 11 24,5 24,5 CH2 12 123,8 123,8 C 5,27 (br s) 13 144,7 144,8 C 14 42,9 42,9 C 15 28,8 28,9 CH2 16 23,9 24,0 CH2 17 48,0 48,0 C 18 42,5 42,6 CH 19 47,2 47,3 CH2 20 31,5 31,5 C 21 34,9 34,9 CH2 22 33,1 33,2 CH2 23 28,5 28,5 CH3 0,95(s) 24 17,0 17,0 CH3 0,93(s) 25 16,0 16,0 CH3 0,81(s) 26 17,7 17,7 CH3 0,85(s) 27 26,3 26,3 CH3 1,17(s) 28 178,0 178,1 COOR 29 33,4 33,5 CH3 1,05(s) 30 24,0 24,0 CH3 0,96(s) Đường GlcA 1ʹ 106,3 106,4 CH 4,01 (d, J = 1,0 Hz) 2ʹ 76,4 76,4 CH 3ʹ 81,9 82,0 CH 4ʹ 79,3 79,4 CH 5ʹ 78,1 78,1 CH 6ʹ 176,5 176,4 COOH Đường Glc I

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU 21 1ʹʹ 104,5 104,4 CH 4,92 (d, J = 8,0 Hz) 2ʹʹ 75,5 75,6 CH 3ʹʹ 78,3 78,3 CH 4ʹʹ 71,0 71,1 CH 5ʹʹ 78,3 78,3 CH 6ʹʹ 62,4 62,4 CH2 Đường Ara(f) 1ʹʹʹ 108,3 108,3 CH 5,19 (br s) 2ʹʹʹ 82,1 82,1 CH 3ʹʹʹ 75,3 75,3 CH 4ʹʹʹ 87,1 87,1 CH 5ʹʹʹ 62,4 62,4 CH2 Đường Glc II 1ʹʹʹʹ 95,7 95,7 CH 5,40 (d, J = 8,0 Hz) 2ʹʹʹʹ 73,9 73,9 CH 3ʹʹʹʹ 77,9 77,9 CH 4ʹʹʹʹ 71,4 71,1 CH 5ʹʹʹʹ 78,6 78,7 CH 6ʹʹʹʹ 62,2 62,2 CH2

*c của stipuleanosid R2 đo trong CD3OD [25]; aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz.

Hợp chất stipuleanosid R2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng, năng suất quay cực riêng [α] =+7,5 (c 0,2, MeOH). Hợp chất này phản ứng với H2SO4 10

% trong điều kiện hơ nóng thấy xuất hiện màu hồng khá đậm, sau đó chuyển sang

màu tím đặc trưng cho các dẫn xuất triterpen. Từ số liệu phổ 13C NMR và DEPT thấy có 7 nhóm CH3, 10 nhóm CH2, 6 nhóm CH và 6 nguyên tử C bậc 4 cùng 1

nhóm COOR. Phổ 13C NMR của stipuleanosid R2 xuất hiện tín hiệu của 30 carbon

đặc trưng cho một saponin có phần aglycon là một triterpene khung oleanan đã

được công bố từ sâm vũ diệp [24]. Phổ 1H NMR xuất hiện 7 tín hiệu singlet của của các nhóm methyl bậc ba tại δ 0,81, 0,85, 0,93, 0,95, 0,96, 1,05, 1,17 (7 tín hiệu CH3, s, CH3-25, 26, 24, 23, 30, 29, 27), một nối đôi ở C-12/C-13 với sự có mặt của tín hiệu tại [δ 5,27 (1H, br s, H-12)]. Ngoài ra trên phổ này còn xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng trong vùng từ δ 3,0-4,0 đặc trưng cho sự có mặt của các nhóm

oxymetin và oxymethylen của 4 phân tử đường. Bốn phân tử đường bao gồm một

đơn vị glucorunic acid (GluA), hai đơn vị glucose (Glc) và một arabifuranose

[Ara(f)] được nhận biết bởi các tín hiệu proton anomeric tại δ 4,01 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-1ʹ), 4,92 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1ʹʹ), 5,19 (1H, br s, H-1ʹʹʹ), 5,40 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1ʹʹʹʹ). Trên phổ13C NMR xuất hiện tín hiệu của 53 tín hiệu nguyên tử cacbon,

trong đó có 23 tín hiệu được xác định thuộc bốn đơn vị đường [GluA, 2 Glc và Ara(f)] [17] và 30 tín hiệu còn lại thuộc phần aglycon oleanolic acid với một

oxymethin tại δ 91,03 (C-3), nối đôi đặc trưng C-12/C-13 tại δ 123,8 và 144,7 ppm

cùng với một nhóm carbonyl acid carboxylic tại δ 178,1 (C-28) [23-24]. Hơn nữa,

phổ khối ESI-MS của stipuleanosid R2 xuất hiện pic ion tại 1087 [M-H]- phù hợp với công thức phân tử C53H84O23 (M = 1088). Từ những dữ kiện phổ trên kết hợp với so sánh số liệu phổ NMR trong tài liệu đã được công bố [25] cho phép xác định cấu trúc hóa học chính xác là stipuleanosid R2 (hình 3.4).

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất stipuleanosid R2

3.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được bằng HPLC HPLC

3.3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Tham khảo phương pháp nghiên cứu trong đề tài “Nghiên cứu thành phần saponin của thân rễ sâm vũ diệp” – luận văn Thạc sĩ của Nguyễn Thị Thu Thủy và

các phương phápđịnh lượng hợp chất saponin bằng HPLC [26], chúng tôi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký đểphân tích như sau:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1260 Infinity

- Cột sắc ký: Agilent Eclipse Plus C18 (ϕ 4,6 × 100 mm; cỡ hạt3,5μm)

- Detector DAD phát hiện ở bước sóng 203nm

- Tốc độ dòng: 0,8mL/phút

- Thể thích bơm mẫu: 20µl

- Nhiệt độ: 25oC

- Dung môi pha mẫu: Methanol

- Pha động: Acetonitril (kênh A) : 0,5% acid acetic/H2O (kênh B) với chương

trình gradient như bảng 3.4

Bảng 3.4. Chương trình dung môi

Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid acetic 0,5% (%) 0-5 20 80 25-15 20→40 80→60 15-20 40 60 20-30 40→100 60→0 30-35 100 0 35-40 100→20 0→80 40-45 20 80

3.3.2. Nhận dạng pic trên sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được

Pha mẫu stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 1,0 mg chất rồi pha thành dung dịch tương ứng với nồng độ 1000 µg/mL

trong methanol, sau đó siêu âm 10 phút, rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Pha mẫu thử: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 100,0 mg cao n-

butanol thân rễ SVD rồi hòa tan trong methanol với nồng độ 100,0 mg/mL, siêu

âm 10phút, lytâmlấydịchchiếtrồilọcquamànglọc 0,45µm.

Pha mẫu chất chuẩn liên kết stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính

xác khoảng 1,0 mg stipuleanosid R2 rồi hòa tan trong methanol với nồng độ 400,0

µg/mL, siêu âm 10phút, lọc quamànglọc0,45µm.

Tiến hành sắc ký HPLC hợp chất phân lập được và cao butanol so sánh

Hình 3.5. SKĐ HPLC của stipuleanosid R2 phân lập được (A), cao BuOH (B)và chất chuẩn đối chiếu (C)

Nhận xét: Kết quả phân tích HPLC minh họa cho thấy stipuleanosid R2 là hợp chất

thiên nhiên có trong SVD với thông số thời gian lưu trong dung dịch cao butanol được chuẩn bị tại thời điểm chạy sắc ký với điều kiện chiết xuất chuẩn thường quy

là lần lượt là 15,565 và 15.564 phút, giá trị này tương đương với thời gian lưu của

chất chuẩn là 15.565 phút.

3.3.3. Địnhlượng stipuleanosid R2 phân lập được

Yêu cầu: Hàm lượng không được thấp hơn 95,0% tính theo nguyên trạng.

Tiến hành:

Pha mẫu hợp chất stipuleanosid R2 phân lập được: dùng cân phân tích cân chính xác 6 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10 mg chất phân lập vào bình định mức 20 mL, hòa tan

và pha loãng vừa đủ bằng MeOH, sau đó siêu âm 10 phút, rồi lọc qua màng lọc 0,45

µm.

Pha mẫu dung dịch đối chiếu stipuleanosid R2: dùng cân phân tích cân chính xác khoảng 10 mg chuẩn stipuleanosid R2 vào bình định mức 20 mL, hòa tan và pha

loãng vừa đủ bằng MeOH, siêu âm 10 phút, ly tâm lấy dịch chiết rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Tiến hành chạy HPLC với điều kiện sắc ký như đã nêu ở mục 3.3.1

Thu được kết quả sắc ký trình bày ở bảng 3.6

Bảng 3.6. Kết quảđịnh lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn

Mẫu thử Khối lượng (mg) Diện tích pic (mAU*s)

Hàm lượng (%) Pic chính Tổng pic 1 9,45 1353,027 1411,314 95,87 2 10,17 1428,131 1483,772 96,25 3 9,34 1249,639 1299,271 96,18 4 9,61 1397,682 1444,782 96,74 5 10,28 1442,078 1499,042 96,20 6 10,74 1482,191 1542,503 96,09 Hàm lượng trung bình (%) 96,22  0,11 RSD (%) 0,26

Nhận xét: Các mẫu thửđều có hàm lượng lớn hơn 95,0% (tính theo nguyên trạng), theo lý thuyết là đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu, tuy nhiên chưa thể

kết luận một cách chắc chắn, cần phải tiến hành thêm các phương pháp đặc hiệu và

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế

4.1.1 Chiết xuất

Với quy trình chiết xuất dược liệu SVD bằng phương pháp chiết siêu âm sử

dụng dung môi ethanol 70o, cất quay thu cắn toàn phần, phương pháp chiết siêu âm

có ưu điểm làm tăng tốc độ chiết, giảm nhiệt độ và áp suất khi chiết. Từ cao chiết toàn phần phân đoạn lần lượt bằng phương pháp chiết lỏng - lỏng với các dung môi

có độ phân cực tăng dần: ether, ethyl acetat và n-butanol thu được các cắn phân

đoạn với khối lượng ether (1,26 %), EtOAc (0,59 %), BuOH (4,71%) so với nguyên liệu khô ban đầu. Hợp chất stipuleanosid R2 bản chất là một saponin phân cực, chính vì vậy việc chiết lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần nhằm mục đích loại bỏ các thành phần không phân cực và kém phân cực tan trong dung môi ether và ethyl acetat, chuẩn bị cho bước phân lập được tiến hành nhanh và

chính xác hơn.

4.1.2 Phân lập và tinh chế

Phân đoạn n-butanol thu được với hàm lượng cao nhất và được sử dụng để

tiến hành phân lập stipuleanosid R2 bằng sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi rửa

giải CH2Cl2 – MeOH theo gradient nồng độ. Kết hợp với SKLM để đánh giá từng

phân đoạn thu được, cho thấy phân đoạn B4 cho sắc ký đồ trên bản mỏng có một vết màu hồng tím rõ nét phù hợp so với đặc tính của hợp chất cần phân lập. Sau đó

chúng tôi đã tiến hành sắc ký cột pha đảo để tinh chế được stipuleanosid R2 trong

dược liệu SVD thu được 180 mg bột màu trắng. Kiểm tra độ tinh khiết của chất tinh chế được bằng phương pháp SKLM cho thấy cắn tinh chế được hiện một vết màu hồng sau đó chuyển sang màu tím, đây là đặc trưng của dẫn xuất triterpen. Kết quả

này cũng góp phần đánh giá stipuleanosid R2 tinh chế được có độ tinh khiết khá cao, có thể ứng dụng phương pháp này trong việc phân lập hợp chất stipuleanosid

R2 trong SVD và các dược liệu khác chứa thành phần này.

Như đã trình bày ở phần tổng quan, stipuleanosid R2 có nhiều tác dụng dược lý rất có ý nghĩa trên lâm sàng, có thể sử dụng đểđiều trị nhiều bệnh trong đó có tác

dụng gây độc trên một số dòng tế bào ung thư. Hiện nay các tác dụng này của

stipuleanosid R2 chưa được dùng nhiều trên lâm sàng nhưng nếu trong tương lai stipuleanosid R2 được nghiên cứu sử dụng rộng rãi trên người thì phâp lập và tinh chế stipuleanosid R2 là cần thiết phục vụ cho việc nghiên cứu tác dụng sinh học

như vậy thì quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế mà chúng tôi đưa ra có thể ứng dụng được.

4.2. Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng

Việc xác minh lại cấu trúc của stipuleanosid R2 tinh chế được trong dược

liệu Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) bằng phương pháp phổ cộng hưởng

từ hạt nhân NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và phân tích khối phổ (ESI-MS) đã

khẳng định công thức phân tử cũng như cấu trúc của stipuleanosid R2 tinh chếđược là phù hợp với lý thuyết. Đồng thời kết quả nhiệt độ nóng chảy đo được của chất

phân lập được cũng góp phần khẳng định sản phẩm tinh chế của chúng tôi đúng là

hợp chất stipuleanosid R2.

4.3. Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằng HPLC HPLC

4.3.1. Xây dựng phương pháp

Chúng tôi thực hiện xây dựng phương pháp HPLC với detector DAD để định

tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được. Đề tài sử dụng phương pháp phân tích định lượng saponin bằng HPLC là phương pháp được Dược điển các nước công

nhận đạt yêu cầu về tính tiên tiến so với phương pháp quang phổ hay phương pháp

khối lượng của phần lớn các chuyên luận dược liệu hiện nay. Đây là phương pháp

có nhiều ưu điểm như có thể tiến hành đơn giản từ việc pha mẫu, chuẩn bị dung

môi pha động đến tiến hành sắc ký. Trong khoảng nồng độ khảo sát, giữa diện tích

pic và nồng độ chất phân tích có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ. Phương pháp

còn đảm bảo độđúng và độđặc hiệu cao.

Tham khảo một số tài liệu kết hợp với các điều kiện có sẵn, chúng tôi đã lựa chọn được chương trình sắc ký như mô tảở mục 3.3.1. Với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, chất nghiên cứu trong mẫu thử chuẩn bị từ dịch chiết n-butanol thân rễ SVD và chất phân lập được tách tương đối tốt, pic cân đối, thời gian lưu hợp lý, phù hợp

đểđịnh lượng thành phần trong thân rễ SVD.

4.3.2. Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được 4.3.2.1. Định tính

Kết quả trên SKĐ chạy HPLC của 3 mẫu: stipuleanosid R2 phân lập được,

cao BuOH và chất chuẩn đối chiếu đều cho pic ở thời gian lưu ở khoảng phút thứ

15. Theo các tài liệu nghiên cứu cho đến hiện nay, có thể khẳng định thời gian lưu

đó là của hợp chất stipuleanosid R2.

Bằng phương pháp HPLC với detector UV đã xây dựng để định tính, định

lượng stipuleanosid R2 và xác định giới hạn tạp chất liên quan của stipuleanosid R2 tinh chế được, chúng tôi đã xác định được chính xác hàm lượng stipuleanosid R2

tinh chế được là 96,22  0,11 (%) > 95,0% (tính theo nguyên trạng),

đạt yêu cầu để thiết lập chất chuẩn đối chiếu.

Stipuleanosid R2 được tinh chế và xây dựng thành chất đối chiếu sử dụng trong phân tích, xây dựng tiêu chuẩn. Với mục đích xa hơn là thiết lập chất chuẩn

phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dược liệu SVD, sau khi xác định độ tinh khiết

bằng SKLM và HPLC saponin chính phân lập được, do thời gian có hạn, chúng tôi

mới dừng lại ở việc chiết xuất, phân lập và tinh chế. Việc thiết lập chất chuẩn stipuleanosid R2 còn cần đánh giá thêm một vài chỉ tiêu khác theo tiêu chí của

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Với các kết quả thực nghiệm thu được đềtài đã đạt được các mục tiêu đề ra là: 1. Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 từ dược liệu

sâm vũ diệp.

2. Bước đầu xác minh cấu trúc hóa học, xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng của chất tinh chếđược.

3. Định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được.

Như vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho hợp chất saponin chính từ thân rễ

Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được bằng SKLM

Định lượng stipuleanosid R2 phân lập được