sắc ký trao đổi ion, điện di...
+ Gốc R khâc nhau của acid amin sẽ cho những phản ứng mău riíng biệt của mỗi acid amin: phản ứng xanthoproteic, phản ứng millon...
+ Phản ứng Biuret xâc định liín kết peptide có trong phđn tử protein.
+ Khi đưa pH của dung dịch protein về điểm đẳng điện (pI) bằng dung dịch đệm thích hợp thì câc protein bị trung hòa điện tích. Môi trường có pH gần bằng pI của protein thì protein sẽ bị kết tủa nhiều nhất.
+ Do kích thước phđn tử lớn nín protein không đi qua được câc măng bân thấm. Dựa văo tính chất năy người ta dùng phương phâp thẩm tích để loại muối vă những phần tử nhỏ khâc khỏi dung dịch protein.
5.2. PHĐN TÍCH HỖN HỢP ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÂP SẮC KÝ TRÍN GIẤY TRÍN GIẤY
Nguyín tắc
Trong những điều kiện thí nghiệm nhất định (dung môi, nhiệt độ, loại giấy sắc ký, độ bảo hòa của dung môi trong bình sắc ký...), tốc độ di chuyển của câc acid amin khâc nhau thì khâc nhau vă đặc trưng bởi một hệ số Rf. Nhờ tính chất năy, sau khi sắc ký câc acid amin trong hỗn hợp tâch rời nhau. Sau đó dùng thuốc hiện mău thích hợp để nhận biết câc acid amin.
Hỗn hợp dung môi sắc ký lă một hỗn hợp không trộn lẫn thường gồm nước vă một văi dung môi hữu cơ khâc. Trong đó nước có âi lực mạnh với giấy sắc ký nhờ có liín kết cầu hydro sẽ giữ vai trò pha đứng yín, còn dung môi hữu cơ lă pha di động.
Câc acid amin khâc nhau sẽ bị lôi cuốn bởi pha di động với vận tốc di chuyển khâc nhau vă sẽ tâch dần khỏi hỗn hợp acid amin. Hệ số Rf được dùng để đânh giâ sự di chuyển năy. Rf: lă hệ số giữa khoảng câch từ điểm xuất phât tới tđm điểm của vật vă được tính như sau:
Rf = a/ b
Với: a: khoảng câch từ điểm xuất phât tới tđm điểm của vật
b: khoảng câch từ điểm xuất phât tới vạch cuối của dung môi.
Sau khi sắc ký, câc acid amin được nhận diện bằng câch lăm hiện mău vă so sânh Rf của nó với Rf của câc acid amin chuẩn trong cùng điều kiện thí nghiệm.
Thuốc thử
- Sakaguchi I: Napthol 0,01 gam + 5 gam urea trong 1000 mL C2H5OH 95o - Sakaguchi II: 2 gam brom trong 100 mL NaOH 5%
- Isatin: 100 mg isatin vă 50 mL butanol có chứa 5% acid acetic đậm đặc - Nynhydrin: 0,2% trong aceton
- Dung môi sắc ký: Butanol: nước: acid acetic theo tỷ lệ 25:15:10
Tiến hănh thí nghiệm
a. Chuẩn bị giấy sắc ký như hình vẽ sau:
b. Chấm dung dịch acid amin lín giấy
- Dùng micropipet chấm lần lượt một giọt nhỏ, gọn từ dung dịch acid amin chuẩn tương ứng đê ghi sẵn vă hỗn hợp acid amin M trín giấy sắc ký. Mỗi lần chấm từng giọt nhỏ gọn trânh sự lan rộng tới vị trí câc acid amin khâc. Sau khi chấm xong một lượt câc acid amin cần sấy ngay. Tiếp tục chấm acid amin lần thứ hai tương tự như lần đầu. C A B II I III M M Pro Pro Val M Leu Arg Arg O 6 cm 1 cm lưỡi gă r = 1,5 cm R = 7,5 cm AOC = manh I COB = manh II AOB = manh III
- Manh giấy hình chữ nhật nhỏ được gấp lăm 3 vă cắt xĩo góc. Đó lă “lưỡi gă”. - Cầm phần trín của “lưỡi gă” đê được gắn xuyín qua khe tđm của giấy sắc ký, đặt giấy sắc ký cđn đối lín beaker sao cho 2/3 bề cao của lưỡi gă nhúng sđu văo hỗn hợp dung môi sắc ký trong beaker. Đậy kín bình sắc ký.
- Theo dõi giấy sắc ký trong khoảng 1 giờ 30 phút, khi dung môi câch gờ của giấy sắc ký 0,5 cm thì cẩn thận mở nắp bình lấy giấy ra, bỏ lưỡi gă, đânh dấu vạch dung môi bằng bút chì vă sấy khô giấy sắc ký.
c. Lăm hiện mău:
Cắt giấy sắc ký lăm 3 manh nhỏ I, II, III (như hình vẽ). + Manh I: lăm hiện mău bằng thuốc thử sakaguchi I, II:
Đầu tiín dùng bình xịt ẩm manh I bằng thuốc thử sakaguchi I, sấy thật khô. Sau lại xịt ẩm tiếp bằng thuốc thử sakaguchi II rồi sấy khô. Nhận xĩt mău của acid amin chuẩn vă acid amin trong hỗn hợp M.
+ Manh II: Lăm hiện mău bằng thuốc thử isatin.
Xịt ẩm manh II bằng dung dịch isatin. Sấy khô. Nhận xĩt mău của acid amin chuẩn vă acid amin trong M.
+ Manh III: Lăm hiện mău bằng thuốc thử nynhydrin.
Xịt ẩm manh III bằng dung dịch nynhydrin. Sấy khô. Nhận xĩt mău của acid amin trín manh năy tương tự như hai manh I vă II.
+ Tính Rf của mỗi acid amin trong hỗn hợp vă mỗi acid amin chuẩn. + Kết luận về câc acid amin trong hỗn hợp M.
Lưu ý:- Luôn giữ giấy sắc ký thật sạch.
- Bình sắc ký luôn giữ cố định tại một vị trí vă phải được đậy thật kín để bảo đảm môi trường bêo hòa dung môi trong suốt thời gian chạy sắc ký. Khi mở vă đậy bình sắc ký: không được nhấc thẳng nắp bình sắc ký mă đẩy nhẹ nắp bình về phía trước hay về phía mình đang đứng.
- Nhiệt độ sấy khô không quâ 60OC.