CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.5. Phương pháp phân tích [3]
2.5.1. Xác định hàm lượng amoni bằng phương pháp so màu với thuốc thử Nessler
2.5.1.1. Nguyên tắc
Amoni trong môi trường kiềm phản ứng với thuốc thử Nessler (K2HgI4) tạo phức có màu vàng hay nâu sẫm phụ thuộc vào hàm lượng Amoni có trong nước.
NH4++ OH- ® NH3 + H2O
2K2HgI4 + NH3 + KOH → NH2Hg2I3 + 5KI + H2O (25)
Các ion sắt, canxi, magiê,... trong nước gây cản trở phản ứng nên cần phải loại bỏ bằng dung dịch Xecnhet hay dung dịch Complexon III. Nước đục được xử lý bằng dung dịch ZnSO4 5%. Clo dư trong nước được loại trừ bằng dung
Màu tạo ra do thuốc thử Nessler được định lượng gián tiếp bằng máy đo màu ở bước sóng 420 nm.
2.5.1.2. Tiến hành phân tích
Pha loãng mẫu bằng nước cất sao cho nồng độ mẫu nằm trong khoảng đường chuẩn. Lấy 5 ml mẫu cho vào ống nghiệm khô, thêm 0.2 ml Xecnhet và 0.3 ml Nessler, lắc đều, để yên 10 phút cho màu ổn định và đo quang ở bước sóng 420 nm. Tính toán nồng độ amoni trong mẫu theo phương trình đường chuẩn.
Hình 2.5: Phương trình đường chuẩn của amoni
2.5.2. Xác định hàm lượng nitrit (NO2-) trong nước bằng phương pháp so màu với thuốc thử Griss
2.5.2.1. Nguyên tắc
Trong môi trường axit axetic, ion nitrit phản ứng với axit sunfanilic và α- naphtylamin tạo thành hợp chất có màu đỏ.
C6H4(NH2)SO2 – OH + HNO2 → C6H4(N=NOH)SO2 – OH C6H4(N=NOH)SO2– OH +C10H7NH2→C6H4(N=N–C10H6NH2)SO2–OH
0 2 4 6 8 10 12
0 0.155 0.264 0.391 0.528 0.636 0.799 0.944 1.037 1.105 1.18
Nồng độ amoni (g/ml)
ABS y = 0,1218x+0,031
R2= 0,9924
Đường chuẩn amoni
Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng nitrit trong nước. Đem đo quang trên máy ở bước sóng 520 nm, từ mật độ quang thu được và dựa vào phương trình đường chuẩn ta rút ra được hàm lượng nitrit tương ứng. Ion NO3-
không gây ảnh hưởng gì cho việc xác định.
2.5.2.2. Tiến hành phân tích
Lấy 5 ml mẫu nước cho vào ống nghiệm khô, thêm 1ml axit sunfanilic và 1ml a-naphtylamin. Lắc đều, để yên 20 phút rồi đem đo mật độ quang ở bước sóng 520 nm. Tính toán nồng độ nitrit trong mẫu theo phương trình đường chuẩn.
Hình 2.6: Phương trình đường chuẩn của nitrit 2.5.3. Xác định nitrat (NO3
-) trong nước bằng phương pháp so màu với thuốc thử phenolđisunfonic
2.5.3.1. Nguyên tắc
Ion nitrat tác dụng với phenoldisunfonic tạo thành axit nitrophenol- đisunfonic. Axit này khi phản ứng với ammoniac tạo phức màu vàng. Cường độ màu tỉ lệ với hàm lượng nitrat trong dung dịch. Có thể đo độ hấp thụ quang trên
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
0.032 0.093 0.151 0.211 0.279 0.35 0.398 0.462 0.523 0.579 0.637
Nồng độ (mg/l)
ABS Đường chuẩn nitrit
Đường chuẩn
máy đo màu ở bước sóng 410 nm. Hàm lượng nitrat tối đa phát hiện được theo phương trình này là 10 mg/1.
2.5.3.2. Tiến hành phân tích
Lấy 5 ml mẫu cho vào cốc, đun cạn. Thêm 0.5 ml axit phenoldisunfonic, 5ml NH3 đặc, lắc đều. Thêm khoảng 10 ml nước cất, lắc đều. Chuyển tất cả vào bình định mức 25 ml, thêm nước cất đến vạch mức. Để yên 10 phút, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 410 nm. Tính toán nồng độ nitrat trong mẫu theo phương trình đường chuẩn.
Hình 2.7: Phương trình đường chuẩn của nitrat
2.5.4. Xác định hàm lượng photpho bằng phương pháp đo quang với thuốc thử Amonimolipdat – vanadat
2.5.4.1. Nguyên tắc
Trong môi trường axit, amonimolipdat phản ứng với dung dịch octophotphat tạo thành axit tạp (Axit molipdophotphoric). Với sự có mặt của vanadat axit vanadomolipdophotphoric màu vàng được hình thành. Cường độ màu thể hiện nồng độ phốt phát trong dung dịch. Nồng độ tối thiểu có thể phát hiện được là 10-4 g/L.
Yếu tố ảnh hưởng gây ra bởi sự có mặt của silicdioxyt (SiO2) và muối Asenat khi mẫu bị đun nóng.
Ảnh hưởng của các yếu tố âm là do sự có mặt của các ion: AsO3-
, F-, Br2+, SO32-, S2O82-,… hoặc lượng vượt quá của molipdat. Màu xanh của dung dịch có thể được tạo thành là do sự có mặt của sắt nhưng không ảnh hưởng tới phép phân tích. Các ion không làm ảnh hưởng đến phép phân tích khi nồng độ vượt quá 100(mg/L) gồm: Al3+, Fe2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+, Sr2+, Na+, K+, các muối nitrat, nitrit, sunfat, tetraborat,…
2.5.4.2. Tiến hành phân tích
Lấy 17,5 mL mẫu vào bình định mức 25 mL. Thêm tiếp 5 mL dung dịch thuốc thử molipdat – vanadat và định mức tới vạch mức. Lắc đều rồi để yên trong 10 phút rồi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 470 nm. Tính toán nồng độ photphat trong mẫu theo phương trình đường chuẩn.
Hình 2.8: Phương trình đường chuẩn photphat 2.5.5. Phương pháp xác định COD bằng kalibicromat
2.5.5.1. Nguyên tắc
Dùng dung dịch K2Cr2O7 là chất oxy hóa mạnh để oxy hóa các hợp chất hữu cơ trong môi trường axit H2SO4 đặc và dùng tinh thể Ag2SO4 làm xúc tác cho phản ứng xảy ra hoàn toàn theo phương trình:
y = 0.0271x + 0.0043 R² = 0.9991
Độ hấp thụ quang ABS
Nồng độ (mg/L)
Chất hữu cơ + K2Cr2O7 + 2H+ → CO2 + H2O + 2Cr3+ 2K+
Lượng K2Cr2O7 dư được chuẩn độ lại bằng dung dịch muối Mohr [Fe(NH4)2(SO4)2] với chỉ thị Feroin.
Cl- thường xuyên có mặt trong nước gây ra sai số cho kết quả phân tích:
Cr2O7
2- + 6 Cl- + 14H+ → 3Cl2 +2Cr3+ + 7H2O
Dùng dung dịch Hg2SO4 để loại bỏ ảnh hưởng của Cl- trong quá trình phân tích.
2.5.5.2. Cách tiến hành
Lấy Vm = 5 mL mẫu cần phân tích cho vào bình cầu, thêm V1 = 5 mL hỗn hợp dung dịch K2Cr2O7 0,25N và HgSO4, thêm tiếp 10ml hỗn hợp dung dịch Ag2SO4 trong H2SO4 đặc với hàm lượng Ag2SO4 là 11 gam/lít dung dịch H2SO4
đặc, thêm 2 – 3 viên đá bọt, lắc đều. Lắp bình cầu vào sinh hàn hồi lưu. Đun hồi lưu trong 2 giờ, để nguội đến nhiệt độ phòng rồi chuyển toàn bộ dung dịch trong bình cầu sang bình nón, tráng bình cầu 2 – 3 lần bằng nước cất. Thêm 1 – 2 giọt chỉ thị Feroin, lắc đều. Chuẩn độ K2Cr2O7 dư bằng dung dịch muối Mohr 0,1N cho đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu nâu đỏ thì kết thúc phép chuẩn độ.
Chỉ số COD được xác định theo công thức:
COD =
1000
. 1 2 8
1
m morh
V
N V N V
Trong đó: Vm: Thể tích mẫu đem phân tích (mL).
V1: Thể tích dung dịch K2Cr2O7 (mL)
Vmohr: Thể tích muối Mohr để chuẩn lượng K2Cr2O7 dư (mL).
N1: Nồng độ đương lượng của K2Cr2O7 (N) N2: Nồng độ đương lượng của muối Morh (N).
8: Đương lượng gam của oxy
1000: Hệ số chuyển đổi thể tích từ lít sang mL
2.5.6. Phân tích vi sinh vật (VSV) 2.5.6.1. Lấy mẫu phân tích VSV
Mực nước Cát vàng
Sỏi nhỏ Sỏi to
Hình 2.9: Các mẫu lấy để phân tích vi sinh vật - Mẫu đất được lấy bằng ống khoan đường kính 5 cm để các tầng mẫu không bị xáo trộn.
- Mẫu ở bề mặt tầng đáy (M1), điểm giữa (M2) và điểm cuối (M3) theo độ sâu được lựa chọn để phân tích VSV. Ngoài ra mẫu M4 được thu trong vùng rễ.
2.5.6.2. Chỉ tiêu VSV cần phân tích (phương pháp MPN)
Nuôi vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu, theo dõi trong thời gian 2 tuần.
a. Vi khuẩn oxy hóa amoni (AOB)
- Đếm trong môi trường khoáng 5 mM NH4 + - Thử bằng phương pháp Gries (phát hiện NO2) b. Vi khuẩn oxy hóa nitrit (NOB)
- Đếm trong môi trường khoáng 5 mM NO2
- Thử bằng phương pháp diphenylamine (phát hiện NO3
) c. Vi khuẩn khử nitrat (NRB)
- Đếm trong môi trường có acetate (10 mM) và NO3
(5 mM) - Phát hiện bằng bọt khí tạo ra trong bình nuôi (do N2 tạo ra) 2.5.7. Các phương pháp sinh học phân tử
- Tách DNA tổng số trực tiếp từ các ống MPN theo phương pháp của Zhou [35]
M1
M2 40 cm
M3 M4
- Điện di kiểm tra sản phẩm DNA: gel agarose 1% trong đệm TAE tại 100V trong thời gian 15 phút. Gel agarose được nhuộm trong dung dịch Ethidium bromide (5 mg/ml) trong 10 phút và quan sát dưới tia UV
- PCR-DGGE gen 16S rDNA [19]
- Cắt băng, thôi gel và giải trình từ theo phương pháp của Muyzer và cs mô tả [19]