Công đoạn khử màu chitin với dung dịch H2O2 được đề xuất theo quy trình Hình 3.6.
Khử màu với H2O2 0,5%, 12h, 1/15 (w/v), nhiệt độ phòng
Hình 3.6. Quy trình khử màu chitin
Đánh giá chất lượng chitin sau xử lý.
Chitin sau xử lý được phân tích các thông số hóa học cơ bản, kết quả phân tích được trình bày trong Bảng 3.2
Chitin khô chưa khử màu Rửa trung tính Chitin thu được
Bảng 3.2. Các thông số thu được trước và sau khử màu
Thông số Chitin trước xử lý màu Chitin sau xử lý màu
Độ ẩm (%) 7,98 ± 0,22 6,34 ± 0,50
Màu sắc Đỏ hồng Màu trắng sáng
Hàm lượng protein (*) (%) 0,83 ± 0,08 0,82 ± 0,16
Hàm lượng khoáng (*) (%) 0,97 ± 0,05 0,96 ± 0,03
Hàm lượng astaxanthin (*) (mg/kg) 7,6 ± 1,4 2,75 ± 0,09
Trọng lượng phân tử (*) (Kdal) 1135,79 ± 34,52 1076,364 ± 42,1
(*) Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối.
Chitin sau xử lý màu có màu trắng sáng, hàm lượng astaxanthin còn lại 1076,364 (Kdal), phân tử lượng trung bình là 1076,364 (Kdal). Hàm lượng khoáng và protein giảm so với chitin ban đầu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Việc khử màu chitin phụ thuộc vào nhiều các yếu tố: nồng độ, tỷ lệ, thời gian, kích thước chitin. Qua kết quả thí nghiệm cho thấy chitin được khử màu với H2O2 0,5%, tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 là 1/15 (w/v), thời gian khử thích hợp là 12 giờ đạt hiệu suất khử màu tốt nhất hạn chế quá trình cắt mạch chitin. Chitin sau xử lý có phân tử lượng 1076,364 (Kdal) hàm lượng astaxanthin 2,75 (mg/kg), hàm lượng protein, khoáng đáp ứng yêu cầu thương mại.
Kiến nghị
Cần tiến hành phân tích XRay, FTIR mẫu chitin sau xử lý để đánh giá ảnh hưởng của quá trình xử lý H2O2 đến độ rắn và cấu trúc của chitin.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1] Hoàng Thị Huệ An (2004), "Nghiên cứu chiết xuất astaxanthin từ phế liệu vỏ tôm," Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, Số Đặc biệt, 51-54.
[2] Đỗ Đình Ràng và Phạm Đình Cường, "Xác định hàm lượng chitin của vỏ một số loài thủy sản Việt Nam," Tạp chí Hóa Học và CNHC số 7, 2000. [3] Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) Nghiên cứu tách chiết chitin từ
đầu tôm - vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học. In: Tập chí khoa học và công nghệ tập 45, số 4. p tr.43-50.
[4] Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007), "Nghiên cứu tách chiết chitin từ đầu tôm - vỏ tôm bằng các phương pháp sinh học," Tập chí khoa học và công nghệ tập 45, số 4, tr.43-50.
[5] Mai Xuân Tịnh (2001), "Điều chế chitin/ chitosan từ vỏ tôm phế thải," Tạp chí Hóa hoc và công nghệ hữu cơ 69.
[6] Trang Sĩ Trung, Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn và Nguyễn Thị Hằng Phương (2010), Chitin – Chitosan từ phế liệu thủy sản và ứng dụng, , NXB Nông Nghiệp
[7] Trang Sĩ Trung, Vũ Ngọc Bội và Phạm Thị Đan Phượng ((2007)), " "Nghiên cứu kết hợp enzym protease trong công nghệ sản xuất chitin từ phế liệu đầu vỏ tôm"," Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản. 3, pp. 11-17.
Tiếng Anh
[8] AOAC. (1990), Official Method of Analysis (Vol. 15th), Association of official analytical chemists, Arlington, VA
[9] F. Nanjo, R. Katsumi and K. Sakai (1991), "Enzymatic method for determination of the degree of deacetylation of chitosan," Analytical biochemistry, 193, 164 - 167.
[10] George A.F. Robert, "Chitin Chemistry," Senior Lecturer in Dyeing No Hingham Polytecnic, Mac. London, 1992.
[11] Henry E. and Robert H. (2000), "Effects of ozone and oxygen on the degradation of carotenoids in an aqueous model system. Journal of Agricultural and Food Chemistry,"48, pp. 5008-5013.
[12] Herman L W. (1986), "The Mark - Houwink - Sakurada Relation for Poly ( Methyl Methacrylate),"
[13] Kim S. K. (2010), Chitin, chitosan, Oligosaccharides and Their derivatives, Biological Activities and Applications
[14] Muzzarelli R. A. A. (1977), "Chitin,"pp. 155 - 181.
[15] No H. K. and Meyers S. P. (1995), "Preparation and characterization of chitin and chitosan-A review," Aquat Food Prod Technol, 4, 27-52.
[16] No H. K. and Meyers S. P. (1997), Praparation of chitin and chitosan, Atec Edizioni, Italy
[17] P. Gross E. K. and H. Mager, "In Chitin & Chitosan, The Japan Society of Chitin & Chitosan," Tohohori, 1982.
[18] Rinaudo M. (2006), "Chitin and chitosan: Properties and applications," Prog. Polym. Sci, 31, 603-632.
[19] Ruth. F.I and Gill. D.M (1964), "A Micro-Biuret method for estimating proteins," Analytical biochemistry, 9, 401 - 410.
[20] Sachindra N. M., Bhaskar N. and Mahendrakar N. S. (2005), "Carotenoids in different body components of Indian shrimps," Journal of the Science of Food and Agriculture, 85, 167-172.
[21] Seo. S.-w., "DEPOLYMERIZATION AND DECOLORIZATION OF CHITOSAN BY OZONE TREATMENT," Chung-Ang University, August 2006.
[22] Shahidi F. and Synowiecki J. (1991), "Isolation and characterization of nutrients and value-added products from snow crab ( Chionoecetes opilio ) and shrimp ( Pandalus borealis) processing discards," Agric Food Chem Biol Interact, 39, 1527-1532.
[23] Tao W. and Svetlana Z. (2008), "Determination of the degree of acetylation (DA) of chitin and chitosan by an improved first derivative UV method,"
Carbohydrate Polymers, 73, 248-253.
[24] Tao W. and Svetlana Z. (2008), "Determination of the degree of acetylation (DA) of chitin and chitosan by an improved first derivative UV method,"
Carbohydrate Polymers 73, 248-253.
[25] Youn. D. K., No. H. K., Kim. D. S. and Prinyawiwatkul. W. (2007), "Decoloration of chitosan by UV irradiation,"
[26] Suganuma K., Nakajima H., Ohtsuki M. and Imokawa G. (2010), "Astaxanthin attenuates the UVA-induced up-regulation of matrix- metalloproteinase-1 and skin fibroblast elastase in human dermal fibroblasts," Journal of dermatological science, 58, 136-142.
[27] Zhao Y., Park R. D. and Muzzarelli R. A. (2010), "Chitin deacetylases: properties and applications," Mar Drugs, 8, 24-46.
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích chính sử dụng trong đề tài
1. Phân tích hàm lượng ẩm khoáng theo phương pháp chuẩn của AOAC, 1990 [8]
Cốc sấy được sấy khô ở nhiệt độ 1050C trong 5 - 6 giờ (đến khối lượng không đổi), sau đó để trong bình hút ẩm để làm nguội. Cân xác định khối lượng của cốc sấy là W1. Cho mẫu cho vào cốc sấy cân được khối lượng W2. Sấy ở 105oC trong 24 giờ, cân được khối lượng W3 (AOAC, 1990). Tất cả khối lượng xác định đều tính theo gram. Hàm lượng ẩm tính theo công thức sau:
% Hàm lượng ẩm = [(W2 – W3)/ (W2 – W1)] x 100
Sau khi xác định hàm lượng ẩm, ta đem nung cốc sấy có chứa mẫu khô ở nhiệt độ 600oC, khoảng 6 giờ, để trong bình hút ẩm và cân được khối lượng W4. Hàm lượng tro được xác định theo công thức sau:
% Hàm lượng tro = [(W4 – W1)/ (W2 – W1)] x 100
2. Hàm lượng protein chitin được xác định theo phương pháp microbiuret của Ruth và cộng sự [19]
a. Thuốc thử microbiuret
Dung dịch 1: Hòa tan 173 g Sodium citrate và 100 g Sodium Carbonate trong 500 ml nước cất.
Dung dịch 2: Hòa tan 17,3 g Copper Sulphate trong 100 ml nước cất.
Trộn dung dịch 1 và dung dịch 2 sau đó làm đầy đến 1000 ml bằng nước cất. Dung dịch thuốc thử được chứa trong chai màu.
b. Xây dựng đường chuẩn
Pha dung dịch BSA thành các nồng độ 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 mg/ml. Cho vào mỗi ống nghiệm 4 ml dung dịch BSA chuẩn sau đó thêm 200 µl dung dịch thuốc thử Microbiuret, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, sau đó đo UV ở bước sóng 330 nm.
Từ các số liệu thu được, lập phương trình đường chuẩn để từ đó tích toán hàm lượng protein trong mẫu.
c. Phương pháp chiết mẫu
Cân 1g chitin – chitosan, thêm 10 ml NaOH 3% sau đó ủ ở 80oC trong 8 giờ, sau khi ủ, tiến hành lọc khối ủ (sử dụng 10 – 15 ml NaOH 3% để rữa mẫu). Định mức dịch lọc đến một thể tích nhất định (V1).
Dịch lọc được mang đi ly tâm với tốc độ 5000 vòng trong 15 phút.
Sử dụng 4 ml dịch sau ly tâm sau đó thêm 200µl dung dịch thuốc thử microbiuret, ủ trong 15 phút ở nhiệt độ phòng và do màu ở bước sóng 330 nm.
Từ giá trị OD thu được, thay vào phương trình đường chuẩn để suy ra hàm lượng protein trong mẫu.
d. Tính toán kết quả
Hàm lượng protein của mẫu chitin chitosan được xác định theo công thức sau
Trong đó:
V1: thể tích dịch lọc (ml)
C: Hàm lượng protein tính theo đường chuẩn microbiuret (mg/ml) W: khối lượng mẫu ủ (g)
MC: độ ẩm của mẫu (%) % Protein (dry basis)
w (g) x (100-MC)/100 x 1000 mg/g
V1 (ml) x C (mg/ml) x 100 =
3. Hàm lượng astaxanthin được xác định theo phương pháp quang phổ của Sachindra và cộng sự [20]
Pha dung môi hexan: isopropanol = 3:2 (v/v). Sau đó, cân 2 gam chitin cho vào 30 ml dung môi (tỉ lệ chitin/dung môi là 1/15 (w/v) vừa pha chứa trong cốc thủy tinh tiến hành ngâm trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng.
Phần bã: tiếp tục cho 30ml vào phần bã và ngâm trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ phòng rồi tiến hành lọc như trên.
Phần dịch: thu được từ 3 lần lọc như trên đem đi định mức ở 100ml.
Tiến hành đi đo OD với bước sóng 468nm. Mẫu trắng để đo là dung môi trên. Công thức tính hàm lượng astaxanthin:
C (µg/g mẫu) = 0,2.G . . ADV Trong đó:
C: là hàm lượng astaxanthin (µg/g mẫu). A: độ hấp thụ của dung dịch ở 468 nm. V: thể tích pha loãng (ml).
D: hệ số pha loãng.
G: trọng lượng mẫu khô (g).
0,2: là độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 468 nm của 1 µg/ml astaxanthin chuẩn.
4. Độ deacetyl của chitin được phân tích theo phương pháp của Tao và cộng sự [24]
a. Xây dựng đường chuẩn N-acetyl glucosamine
Hòa tan 0,1105 g N-acetyl glucosamine trong 10 ml H3PO4 được dung dịch có nồng độ 0,05 M
Lấy 2 ml dung dịch trên sau đó thêm 98 ml nước cất được dung dịch có nồng độ 0,001 M.
Từ dung dịch trên ta pha thành các dung dịch có nồng độ tương ứng là 0,0001; 0,0002; 0,0004; 0,0006; 0,0008; 0,001 M.
Sau khi đã có dãy nồng độ như trên, tiến hành đo OD ở bước sóng 210 nm để xây dựng đường chuẩn N-acetyl glucosamine.
b. Chuẩn bị mẫu
Hòa tan 100 mg chitin/chitosan trong 20 ml H3PO4 85 %, khuấy đảo ở 60oC trong vòng 40 phút. Lấy 10 ml dung dịch ở trên định mức đến 100 ml bằng nước cất, sau đó ủ dung dịch trên trong 2 giờ ở 60oC. Sau đó, đo OD ở bước sóng 210 nm.
Từ kết quả đo được, thay vào đường chuẩn N-acetyl glucosamine để tính ra lượng N-acetyl glucosamine.
c. Tính kết quả
Độ deacetyl của chitin/chitosan được tính theo công thức sau
DD = molGcl molGclNAC molGlcNAC 1 * 100 16117 . 0 20321 . 0 * molGclNAC w molGcl Trong đó:
W: khối lượng mẫu khô tuyệt đối
µmol Gcl NAC: hàm lượng N-acetyl glucosamine xác định theo đường chuẩn µmol Gcl: hàm lượng glucosamine.
5. Phân tử lượng chitin được phân tích theo phương pháp đo độ nhớt nội [12]
a. Chuẩn bị
Chuẩn bị dung dịch Axit acetic (CH3COOH) 0,2M: Pha 100ml CH3COOH 0,2M Chuẩn bị Sodium acetate (CH3COONa)
Chuẩn bị dung môi: CH3COOH 0,2M/ CH3COONa 0,1M
Chuẩn bị Chitosan mẫu (0,3%): chitosan mẫu được pha trong CH3COOH 0,2M/ CH3COONa 0,1M.
Dùng xiranh và phin lọc 5 để lọc. b. Tiến hành thí nghiệm
Cài đặt nhiệt độ cho bộ ổn nhiệt: 250C
Dung dịch CH3COOH/CH3COONa là dung môi nên cần phải xác định thời gian chảy của dung môi. Dung dịch CH3COOH/CH3COONa được lọc bằng phin lọc 5 m. Lấy 4 mL dung dịch này đưa vào nhớt kế. Lắp nhớt kế vào giá đỡ, đợi khoảng 10 phút để dung dịch cần đo đạt được nhiệt độ cài đặt trong bể ổn nhiệt. Tiến hành đo. Trên bộ điều khiển cần cài đặt số lần đo và thời gian nghỉ giữa các lần đó, sau đó bấm start. Bộ điều khiển sẽ điều khiển quá trình hoàn toàn tự động. Đầu tiên dịch được hút lên trên ống bên trái của nhớt kế sau khi đến một mức nào đó (cao hơn vạch bắt đầu đếm giờ) thì việc hút dịch ngừng lại. Dịch bắt đầu chảy xuống dưới tác dụng của trọng lực. Đến khi mức dịch ngang bằng với vạch trên thì máy tự động tính giờ. Khi mức dịch ngang bằng với vạch dưới thì sẽ kế thúc quá trình đếm giờ.
Tính trung bình thời gian chảy của dung môi (trung bình cộng của số lần) Làm vệ sinh nhớt kế: rửa sạch bằng nước cất (dùng chân không nước chảy để hút), rửa bằng aceton, làm khô bằng bơm chân không.
Lắp nhớt kế vào giá tiếp tục đo dung dịch cần đo. Làm sạch nhớt kế.
Pha loãng dung dịch ban đầu thành các dung dịch loãng hơn: Pha loãng 1(C1): 1 ml dung dịch ban đầu + 9 ml dung môi Pha loãng 2(C2): 2 ml dung dịch ban đầu + 8 ml dung môi Pha loãng 3(C3): 3 ml dung dịch ban đầu + 7 ml dung môi Pha loãng 4(C4): 4 ml dung dịch ban đầu + 6 ml dung môi Pha loãng 5(C5): 5 ml dung dịch ban đầu + 5 ml dung môi Tiến hành đo thời gian chảy của các dung dịch được pha loãng. Sau mỗi lần đo một dung dịch cần phải làm vệ sinh nhớt kế một lần. c. Tính kết quả
Sau khi có được kết quả là thời gian chảy của dung môi và thời gian chảy của dung dịch cần đo với các nồng độ khác nhau, tiến hành tính toán một số thông số, vẽ đồ thị và từ đó có được độ nhớt nội:
Solution (with polymer) viscosity (độ nhớt dung dịch) : η Solvent viscosity (độ nhớt dung môi) : ηo
Relative viscosity (độ nhớt tương đối) : η = η
ηo= 𝑡
𝑡𝑜
Specific viscosity (độ nhớt cụ thể) : ηsp = η−ηo
ηo = ηr – 1 = 𝑡
𝑡𝑜−1
Do [ η ] = (η sp/C)c→0 = (ηred)c→0 nên ta có thể xác định độ nhớt nội (intrinsic viscosity) bằng cách ngoại suy khi nồng độ bằng không.
Trong đó C: g / ml.
Trọng lượng phân tử trung bình thông qua độ nhớt được tính toán dựa trên các phương trình Mark- Houwink: [ Ƞ ] = KMa
Phụ lục 2: Các hình ảnh cảm quan của chitin trong quá trình khử màu: P2.1. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng khử màu chitin
Hình P2.1.1. Chitin xử lý H2O2 0,1% Hình P2.1.2. Chitin xử lý H2O2 0,3%
Hình P2.1.3. Chitin xử lý H2O2 0,5% Hình P2.1.4. Chitin xử lý H2O2 0,7%
P2.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến khả năng khử màu chitin bằng H2O2
Hình P2.2.1. Chitin thu khử màu 8 giờ Hình P2.2.2. Chitin thu khử màu 12 giờ
Hình P2.2.3. Chitin thu khử màu 16 giờ Hình P2.2.4. Chitin thu khử màu 20 giờ
P2.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ chitin/ dung dịch H2O2 đến khả năng khử màu
Hình P2.3.1. Chitin khử tỉ lệ 1/5 (w/v) Hình P2.3.2. Chitin khử tỉ lệ 1/10 (w/v)
Hình P2.3.3. Chitin khử tỉ lệ 1/15 (w/v) Hình P2.3.4. Chitin khử tỉ lệ 1/20 (w/v)
P2.4. Ảnh hưởng của kích thước chitin đến khả năng khử màu chitin bằng H2O2 Hình P2.4.1. Khử chitin kích thước dạng vẩy Hình P2.4.2. Khử chitin kích thước 2 mm Hình P2.4.3. Khử chitin kích thước 4 mm Hình P2.4.4. Khử chitin kích thước 6 mm Hình P2.4.5. Khử chitin kích thước 8 mm
Phụ lục 3. Kết quả phân tích thí nghiệm sau khi khử màu chitin
Bảng P3.1. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng khử màu chitin
Nồng độ (%) Hàm lượng ẩm (%) Hàm lượng khoáng (*) (%) Hàm lượng protein (*) (%) Astaxanthin (*) (mg/kg) Phân tử lượng (Kdal) 0,1 6,69 ± 0,41 0,75 ± 0,03 0,83 ± 0,06 4,21 ± 0,82 1130,688 ± 38,1 0,3 6,70 ± 0,77 0,73 ± 0,01 0,85 ± 0,07 3,38 ± 0,13 1106,608 ± 32,2 0,5 7,38 ± 0,20 0,72 ± 0,01 0,87 ± 0,05 2,27 ± 0,07 996,010 ± 31,4 0,7 7,98 ± 0,20 0,73 ± 0,03 0,86 ± 0,03 2,26 ± 0,07 734,824 ± 42,3 0,9 7,82 ± 0,25 0,80 ± 0,09 0,82 ± 0,09 2,09 ± 0,04 650,025 ± 33,1
(*) Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối.
Bảng P3.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến khả năng khử màu chitin bằng H2O2 Thời gian (h) Hàm lượng ẩm (%) Hàm lượng khoáng (*) (%) Hàm lượng protein (*) (%) Astaxanthin (*) (mg/kg) Phân tử lượng (Kdal) 8 8,09 ± 0,20 0,80 ± 0,03 0,80 ± 0,03 2,21 ± 0,03 963,201 ± 57,2 12 7,94 ± 0,75 0,78 ± 0,05 0,87 ± 0,02 3,38 ± 0,01 889,210 ± 41,1 16 7,51 ± 0,13 0,80 ± 0,02 0,83 ± 0,04 2,27 ± 0,02 766,066 ± 38,6 20 7,35 ± 0,24 0,79 ± 0,05 0,82 ± 0,06 2,26 ± 0,02 745,934 ± 45,5 24 7,99 ± 0,42 0,83 ± 0,10 0,84 ± 0,05 2,09 ± 0,03 624,610 ± 32,7
Bảng P3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ chitin/ dung dịch H2O2 đến khả năng khử màu Tỉ lệ chitin/ dd H2O2 (w/v) Hàm lượng ẩm (%) Hàm lượng khoáng (*) (%) Hàm lượng protein (*) (%) Astaxanthin (*) (mg/kg) Phân tử lượng (Kdal) 1/5 8,09 ± 0,87 0,83 ± 0,05 0,89 ± 0,06 2,88 ± 0,02 1055,196 ± 32,8 1/10 8,11 ± 0,48 0,80 ± 0,04 0,87 ± 0,06 2,67 ± 0,06 1011,931 ± 47,3 1/15 7,34 ± 0,80 0,81 ± 0,08 0,86 ± 0,01 2,28 ± 0,07 958,371 ± 41,9 1/20 7,07 ± 0,63 0,77 ± 0,07 0,91 ± 0,05 2,20 ± 0,06 697,452 ± 38,6 1/25 7,81 ± 0,67 0,85 ± 0,06 0,89 ± 0,06 2,17 ± 0,03 475,300 ± 37,3
(*) Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối.
Bảng P3.4. Ảnh hưởng của kích thước chitin đến khả năng khử màu chitin bằng H2O2 Kích thước chitin (mm) Hàm lượng ẩm (%) Hàm lượng khoáng (*) (%) Hàm lượng protein (*) (%) Astaxanthin (*) (mg/kg) Phân tử lượng (Kdal) Dạng vẩy 6,34 ± 0,50 0,96 ± 0,03 0,83 ± 0,16 2,75 ± 0,09 1076,364 ± 42,1 2 7,26 ± 0,82 0,91 ± 0,06 0,82 ± 0,07 1,62 ± 0,07 628,824 ± 35,5