H2O2 là tác nhân có tính chất oxy hóa mạnh do vậy khi xử lý nồng độ cao có khả năng cắt mạch chitin nên làm giảm chất lượng tuy nhiên khi xử lý nồng độ thấp thì khả năng oxy hóa kém dẫn đến hiệu quả của quá trình xử lý không cao. Để lựa chọn nồng độ H2O2 thích hợp đến khả năng khử màu chitin (hiệu suất khử màu cao và ít gây cắt mạch chitin), thí nghiệm được bố trí như Hình 2.3.
Ngâm H2O2, tỷ lệ w/v = 1/20 (w/v), 24h, RT, với nồng độ Làm khô ở nhiệt độ 55oC luận Chitin 0,1% 0,3% 0,5% 0,7% 0,9% Rửa trung tính
Mục tiêu thí nghiệm:
Xác định nồng độ H2O2 thích hợp để khử màu chitin và hạn chế sự cắt mạch chitin dẫn đến giảm chất lượng sản phẩm.
Tiến hành thí nghiệm:
Cho chitin sau khi được làm khô ngâm trong dung dịch H2O2 ở các nồng độ: 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9% với tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 là 1/20 (w/v) trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Chitin sau ngâm được rửa trung tính và làm khô (sấy 550C) trước khi tiến hành phân tích phân tử lượng và hàm lượng astaxanthin để lựa chọn nồng độ H2O2 thích hợp trong quá trình khử màu chitin.
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng astaxanthin, phân tử lượng sau khi khử màu chitin. Đánh giá cảm quan sản phẩm chitin sau khi khử.
2.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử màu chitin bằng H2O2
Thời gian tiếp xúc giữa tác nhân oxy hóa và sắc tố là một yếu tố có ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình khử màu, kéo dài thời gian khử màu chitin sẽ tạo điều kiện tăng thời gian cắt mạch chitin gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng. Ngược lại, nếu thời gian khử màu ngắn thì tác nhân oxy hóa chưa tác dụng hết sắc tố làm giảm khả năng khử màu. Do đó thí nghiệm lựa chọn thời gian xử lý H2O2
thích hợp được trình bày trong Hình 2.4.
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian khử màu chitin thích hợp.
Tiến hành thí nghiệm:
Cân chitin sản xuất được bằng phương pháp hóa học tiến hành đi ngâm H2O2
ở nồng độ được xác định ở thí nghiệm 1, nhiệt độ phòng với tỷ lệ mẫu chitin so với lượng H2O2 là 1/20 (w/v) với thời gian ngâm: 8; 12; 16; 18; 24 giờ. Sau khi ngâm xong tiến hành rửa lấy mẫu rồi đi làm khô (sấy 550C) tiến hành đánh giá màu chitin. Cuối cùng đánh giá và chọn ra thời gian xử lý thích hợp để khử màu chitin.
Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng astaxanthin, phân tử lượng sau khi khử màu chitin. Đánh giá chất lượng chitin sau khi khử và chọn ra thời gian khử thích hợp.
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian khử màu chitin bằng H2O2
2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 (w/v) đến khử màu chitin
Nồng độ và thời gian khử đã xác định ở thí nghiệm trên, xác định tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 (w/v) để khử màu chitin đạt hiệu quả cao cũng được quan tâm. Khi khối lượng chitin được khử giữ cố định, việc bổ sung lượng dung dịch khử H2O2 nhiều hay ít là yếu tố ảnh hưởng đến quá trình khử. Khi lượng H2O2 được cung cấp nhiều cho quá trình khử thì tăng tác nhân oxy hóa tác dụng lên lượng sắc tố trong chitin. Nếu lượng H2O2 khử màu hạn chế sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất khử
Chitin
Ngâm H2O2, nồng độ xác định trên, RT, tỷ lệ w/v = 1/20 (w/v), thời gian khử khác nhau
Rửa trung tính
Làm khô ở nhiệt độ 55oC
Đánh giá các thông số chtitin và Kết luận
màu. Việc chọn ra tỷ lệ khử màu không những có tầm quan trọng về chất lượng còn thể hiện tính kinh tế trong sản xuất chitin công nghiệp. Để tìm ra ảnh hưởng của tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 được trình bày ở thí nghiệm Hình 2.5
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ chitin/ dung dịch H2O2 để khử chitin
Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 thích hợp để khử màu chitin.
Tiến hành thí nghiệm:
Tiến hành cho chitin vào ngâm trong dung dịch H2O2 ở các nồng độ và thời gian thích hợp đã xác định ở thí nghiệm trên. Cho khử màu với tỷ lệ mẫu chitin so với lượng H2O2 là 1/5; 1/10; 1/15; 1/20; 1/25 (w/v). Sau khi ngâm xong tiến hành rửa lấy mẫu rồi đi làm khô (sấy 550C) tiến hành đánh giá cảm quan và các thông số
Chitin
Ngâm H2O2, nồng độ, thời gian xác định trên, tỷ lệ chitin/dung dịch khác nhau (w/v)
Rửa trung tính
Làm khô ở nhiệt độ 55oC
Đánh giá các thông số chtitin và Kết luận
chất lượng của chitin. Cuối cùng đánh giá tỷ lệ khử màu chitin so với dung dịch H2O2 hợp lý để xử lý màu chitin.
Chỉ tiêu đánh giá: Xác định hàm lượng astaxanthin, phân tử lượng của chitin sau khi sấy. Đánh giá cảm quan các mẫu chitin sau sấy.
2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitin để khử màu chitin bằng H2O2
Ngoài tác nhân xử lý hóa học trong quá trình khử màu, có thể kết hợp với tác nhân vật lý như xay nhỏ chitin nhằm tăng khả năng tiếp xúc giữa tác nhân oxy hóa với chất màu trong chitin nhằm tạo ra sản phẩm chitin có chất lượng tố hơn. Bên cạnh đó, việc xay nhỏ chitin còn giảm thời gian, nồng độ, tỷ lệ trong quá trình khử màu. Để xem xét việc chọn kích thước xay nhỏ chitin có tăng khả năng khử các sắc tố nhưng hạn chế đến sự cắt mạch của chitin được trình này thí nghiệm như Hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitin
Chitin
Ngâm H2O2, nồng độ, thời gian và tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 xác định, với các kích thước khác nhau
Rửa trung tính
Làm khô ở nhiệt độ 55oC
Chitin vẩy 2 mm 4 mm 6 mm 8 mm
Mục tiêu thí nghiêm: Xác định kích thước chitin khử chitin thích hợp.
Tiến hành thí nghiệm
Lấy chitin sau khi được sản xuất tiến hành đi xử lý ngâm H2O2 với nồng độ khử màu, thời gian xử lý và tỷ lệ khử màu của chitin so với dung dịch H2O2 đã xác định ở các thí nghiệm trên. Sau khi ngâm xong tiến hành rửa lấy mẫu rồi đi làm khô (sấy 550C) tiến hành đánh giá màu chitin. Sau đó, đánh giá cảm quan và các thông số kiểm tra chất lượng của chitin từ đó chọn ra kích thước hợp lý để đi xử lý màu chitin.
Chỉ tiêu đánh giá: Xác định hàm lượng astaxanthin, phân tử lượng của chitin sau quá trình khử màu. Đánh giá cảm quan của chitin sau khử.
Kết quả thăm dò: Xem xét sự thay đổi kích thước chitin ảnh hưởng như thế nào đến khử năng khử màu chitin. Để chọn ra kích thước thích hợp để tiến hành khử màu chitin ở các công đoạn sau.
2.3. Các phương pháp phân tích
Phân tích hàm lượng ẩm khoáng theo phương pháp chuẩn của AOAC, 1990 [8]. Hàm lượng astaxanthin được xác định theo phương pháp quang phổ của Sachindra và cộng sự [20].
Độ deacetyl của chitin được phân tích theo phương pháp của Tao và cộng sự 2008 [24].
Hàm lượng protein trong chitin và trong nguyên liệu tôm được phân tích theo phương pháp microbiuret của Ruth. F.I và cộng sự, 1964 [19].
Phân tử lượng chitin được phân tích theo phương pháp đo độ nhớt nội [12].
2.4. Phương pháp xử lí số liệu
Các phân tích được tiến hành lặp lại 3 lần để đảm bảo thực hiện phân tích ANOVA. Số liệu được phân ích trên phần mềm SPSS 16.0. Kiểm định Tukey được thực hiện sau phân tích ANOVA để đánh giá sự khác nhau của giá trị với mức ý nghĩa p < 0,05.Thống kê số liệu, vẽ đồ thị và biểu đồ được thực hiện trên phần mềm Excel (Microsoft Office, 2010).
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của chitin
Chitin sản xuất theo phương pháp hóa học được làm khô bằng 2 phương pháp: làm khô dưới ánh sáng mặt trời và sấy qua đêm ở nhiệt độ 550C. Chitin sau khi đạt độ ẩm <10% được phân tích các chỉ tiêu về chất lượng, kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 3.1
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của chitin
STT Chỉ tiêu chất lượng Chitin làm khô bằng phương pháp sấy Chitin làm khô bằng phương pháp phơi 1 Màu sắc Đỏ hồng Trắng 2 Phân tử lượng 1135,79 ± 34,52 1129.83 ± 45,23 3 Hàm lượng khoáng (*) (%) 0,97 ± 0,05 0,92 ± 0,06 4 Hàm lượng protein (*) (%) 0,83 ± 0,08 0,85 ± 0,07 5 Astaxanthin (*) (mg/kg) 7,6 ± 1,4 2,13 ± 0,15 6 Độ deacetyl (%) 7,2 ± 2,4 7,5 ± 2,1
(*) Kết quả tính theo hàm lượng chất khô tuyệt đối.
Kết quả Bảng 3.1 cho thấy, chitin sản xuất theo phương pháp hóa học có hàm lượng protein, hàm lượng khoáng còn lại trong chitin thấp tương đối thấp đáp ứng yêu cầu chất lượng của chitin thương mại.
Dựa vào kết quả phân tích cho thấy khi xác định hàm lượng astaxanthin của chitin bằng 2 phương pháp làm khô: phương pháp phơi dưới ánh sáng mặt trời và phương pháp sấy ở 550C thì hàm lượng chitin thu được ở bảng trên có sự chênh lệch về giá trị thu được. Về cảm quan, ta thấy màu của chitin phơi có màu trắng đẹp. Trong khi đó, chitin được làm khô bằng phương pháp sấy lại có màu đỏ hồng chưa đạt chỉ tiêu chất lượng về màu của chitin.
Vậy chitin được làm khô bằng phương pháp sấy vẫn còn một lượng chất màu nhất định. Từ đó, vấn đề đặt ra là khử lượng màu có trong chitin sau khi làm khô bằng phương pháp sấy để chitin đạt được chất lượng về cảm quan và yêu cầu tiêu chuẩn chất lượng của chitin thương mại.
3.2. Nghiên cứu điều kiện khử màu chitin bằng H2O2
Hình 3.1. Chitin thu được từ phương pháp: Phơi (3A) và sấy (3B).
Việc khử màu nhằm mục đích tạo ra chitin đạt tiêu chuẩn chất lượng về màu và hạn chế sự thay đổi đến các thông số chất lượng của chitin do quá trình khử màu bằng tác nhân oxy hóa (H2O2) thường đi cùng với quá trình cắt mạch từ đó ảnh hưởng phân tử lượng của chitin.
Hiệu quả của công đoạn khử màu phụ thuộc vào nồng độ H2O2, thời gian phản ứng, tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch H2O2 và kích thước chitin.
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng khử màu chitin
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến hiệu suất quá trình khử màu chitin được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24 giờ, tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 là 1/20 (w/v) với nồng độ H2O2 dao động 0,1 – 0,9% (bước nhảy 0,2). Chitin sau khi khử màu được phân tích hàm lượng astaxanthin và phân tử lượng, kết quả phân tích được trình bày ở Hình 3.2 phụ lục Bảng P3.1 và Hình P2.1
a b b c c c 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
Hàm lượng Astaxanthin (mg/kg) Trọng lượng phân tử (Kdal)
Nồng độ H2O2(%) Hàm lư ợng astaxanthin (m g/kg) Hàm lư ợng astaxanthin (m g/kg)
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến quá trình khử màu astaxanthin và phân tử lượng của chitin.
Các giá trị trung bình của cột có các kí hiệu (a, b, c) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (p <0,05).
Kết quả Hình 3.2 Cho thấy việc sử dụng H2O2 ở các nồng độ khác nhau có ảnh hưởng đến hàm lượng astaxanthin còn lại và độ dài phân tử chitin. Khi sử dụng H2O2 với nồng độ 0,1 – 0,3%, hàm lượng astaxanthin giảm từ 4,21 còn 3,12 (mg/kg) nhưng trọng lượng phân tử của chitin ít bị ảnh hưởng, số liệu phân tích (Hình 3.2) cho thấy phân tử lượng chitin khi xử lý H2O2 với nồng độ 0,1; 0,3 % lần lượt là 1130,698; 1106,608 (Kdal) và kết quả trên không có sự sai khác về mặt thống kê với p < 0,05.
Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ H2O2 0,5; 0,7; 0,9% mức suy giảm phân tử lượng chitin lớn hơn mức suy giảm về hàm lượng astaxanthin. Hàm lượng astaxanthin phân tích được khi xử lý H2O2 ở các nồng độ 0,5; 0,7; 0,9% đạt được tương ứng là 2,23; 2,25; 2,09 (mg/kg). Trong khi đó giá trị về phân tử lượng chitin khi xử lý H2O2 0,5; 0,7; 0,9% đạt lần lượt là 996,010; 734,824; 650,025 (Kdal). Kết quả phân tích còn cho thấy, sự sai khác về hàm lượng astaxanthin khi xử lý H2O2 với các nồng độ H2O2 khử màu từ 0,5 - 0,9% là không có ý nghĩa thống kê với p <0,05 do vậy nồng độ 0,5% H2O2 được xem là thích hợp cho quá trình khử màu vì việc tăng nồng độ lên 0,7; 0,9% không làm giảm astaxanthin mà độ dài phân tử chitin giảm mạnh. Theo Trang Sĩ Trung và cộng sự 2010, H2O2 là một tác nhân oxy hóa mạnh, khi tương tác với chitin H2O2 thực hiện quá trình oxy hóa astaxanthin đồng thời thực hiện phản ứng cắt mạch chitin vì vậy sản phẩm chitin sau quá trình xử lý H2O2
nồng độ cao 0,7 – 0,9% thường có màu vàng nhạt, trạng thái chitin bị vụn và dễ dập nát. Đối với mẫu xử lý với nồng độ H2O2 từ 0,1 – 0,5% trạng thái chitin sau xử lý có giá trị cảm quan cao hơn so với mẫu trước xử lý (đặc biệt là mẫu xử lý H2O2
0,5%) do quá trình xử lý với H2O2 là quá trình oxy hóa nên sản phẩm sau xử lý có màu trắng, sáng hơn so với ban đầu.
Như vậy, nồng độ H2O2 thích hợp cho quá trình khử màu chitin là 0,5% và kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm sau.
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến khả năng khử màu chitin bằng H2O2
Chitin được xử lý với H2O2 0,5% trong thời gian 8; 12; 16; 20; 24 giờ ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ chitin/dung dịch H2O2 là 1/20 (w/v). Chitin sau xử lý được phân tích hàm lượng astaxanthin và phân tử lượng, kết quả phân tích được trình bày ở Hình 3.3 phụ lục Bảng P3.2 và Hình P2.2
Hình 3.3 Cho thấy thời gian xử lý có ảnh hưởng đến phân tử lượng và hàm lượng astaxanthin.
Khi tăng thời gian xử lý từ 0 – 8 giờ hàm lượng astaxanthin giảm 68,41%, tiếp tục tăng thời gian lên 12 giờ hàm lượng astaxanthin chỉ giảm 5,83% nếu tăng tiếp thời gian lên 16, 20, 24 giờ hàm lượng astaxanthin không thay đổi so với mức
xử lý 12 giờ. Điều này có thể do ban đầu astaxanthin tồn tại nhiều ngoài mạch chitin nên dễ bị oxy hóa, khi lượng astaxanthin liên kết ngoài mạch bị oxy hóa hoàn toàn thì việc tách các phân tử chất màu liên kết sâu bên trong cấu trúc chitin là khó khăn nên hiệu suất khử bị hạn chế.
Xét về phân tử lượng chitin, thời gian xử lý càng tăng thì chitin bị cắt mạch càng mạnh, càng tăng thời gian xử lý phân tử lượng chitin càng bị giảm cụ thể về giá trị phân tử lượng chitin sau thời gian xử lý 8; 12; 16; 20; 24 giờ đạt lần lượt là 936,201; 889,210; 766,066; 745,934; 624,610 (Kdal).
Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian ngâm H2O2 đến quá trình khử màu astaxanthin và phân tử lượng của chitin.
Các giá trị trung bình của cột có các kí hiệu (a, b, c) khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05).
Như vậy khi tăng thời gian xử lý từ 0 – 12 giờ, hàm lượng astaxanthin giảm 70,26%; phân tử lượng chitin giảm 21,71%. Tiếp tục tăng thời gian xử lý lên 16; 20;
a b c c c c 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 8 20 24
Hàm lượng astaxanthin (mg/kg) Trọng lượng phân tử (Kdal)
Hàm lư ợng astaxanthin (m g/kg) Trọng lư ợng phân tử (Kdal) 12 16
24 giờ, hàm lượng astaxanthin không giảm (giá trị trung bình không có sự sai khác về mặt thống kê p < 0,05) nhưng phân tử lượng chitin giảm mạnh do đó, thời gian 12 giờ được lựa chọn để thực hiện quá trình khử màu chitin và kết quả này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ chitin/ dung dịch H2O2 đến khả năng khử màu