2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Bố trí thí nghiệm
Nghiên cứu đƣợc thực hiện thông qua 3 thí nghiệm: (1) thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ lên tỉ lệ sống; (2) thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ lên các chỉ tiêu sinh lý và nồng độ cortisol của cá trong thời gian ngắn hạn 14 ngày; và (3) thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ lên các chỉ tiêu sinh lý và nồng độ cortisol của cá trong thời gian dài 56 ngày.
2.1.1. Thí nghiệm xác định tỉ lệ sống
Thí nghiệm xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ lên tỉ lệ sống của cá đƣợc thực hiện thông quá thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: 24 bể 150 lít nƣớc đƣợc bố trí 100 lít nƣớc đã điều chỉnh nhiệt độ ở các nghiệm thức gồm 21, 24, 27, 29, 31, 33, 36 và 39oC, mỗi nghiệm thức đƣợc bố trí lặp lại 3 lần. Điều chỉnh các thiết bị tạo nhiệt đạt đƣợc nhiệt độ bố trí. Khi tất cả các bể thí nghiệm đạt đƣợc nhiệt độ bố trí và ổn định thì tiến hành bố trí 10 cá (20-25g/con) vào mỗi bể và bắt đầu tính 0 giờ. Trong suốt thời gian thí nghiệm cá không đƣợc cho ăn, không thay nƣớc. Hệ thống sục khí đƣợc áp dụng liên tục trong suốt 96 giờ thí nghiệm.
Trong quá trình thí nghiệm, thời điểm và số lƣợng cá chết đƣợc ghi nhận để xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ lên tỉ lệ sống của cá.
2.1.2. Thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng nhiệt độ đến nồng độ ion Na+ & K+, áp suất thẩm thấu và cortizol trên cá tra
Đƣợc thực hiện bởi hai thí nghiệm, thí nghiệm 14 ngày và thí nghiệm 56 ngày đƣợc bố trí và thu mẫu tƣơng tự nhau. Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức ở 6 mức nhiệt độ khác nhau, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, gồm 18 bể composit. Sử dụng clorine diệt khuẩn trƣớc khi đƣa vào thí nghiệm. Mỗi bể đƣợc lắp đặt hệ thống lọc nƣớc.
23
Hình 11. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên các chỉ tiêu sinh lý ở cá tra.
Các nghiệm thức bao gồm: Nghiệm thức 1: 24°C.
Nghiệm thức 2: nhiệt độ bình thƣờng (270C – 290C) của môi trƣờng (đối chứng).
Nghiệm thức 3: 30°C. Nghiệm thức 4: 32°C. Nghiệm thức 5: 34°C. Nghiệm thức 6: 36°C.
Cá đƣợc thuần dƣỡng trong vòng 2 tuần trƣớc khi bố trí vào bể. Khi cá đã thích nghi đƣợc môi trƣờng nƣớc thí nghiệm, ta tiến hành bố trí cá vào bể 500 L, mật độ 45 con/bể 300 lít nƣớc ở thí nghiệm ngắn hạn (14 ngày) và 51 con/300 lít nƣớc ở thí nghiệm dài hạn 56 ngày. Các nghiệm thức ở nhiệt độ cao sẽ tiến hành nâng trƣớc 20C/ngày, các nghiệm thức nhiệt độ thấp sẽ đƣợc nâng sau đảm bảo đƣợc các nghiệm thức đều đạt đúng nhiệt độ cần thiết lúc 0 giờ. Đối với nghiệm thức 24°C, các bể đƣợc bố trí trong phòng thí nghiệm đƣợc bố
24
trí máy điều hòa không khí, cá đƣợc thả vào và điều chỉnh cho điều hòa giảm dần đến mức nhiệt độ mong muốn. Các bể thí nghiệm đƣợc bố trí hệ thống sục khí. Cá đƣợc cho ăn hàng ngày, tùy theo nhu cầu ăn của từng bể 2 lần/ngày (8 giờ sáng và 4 giờ chiều).
2.2.Thu mẫu và ghi nhận số liệu
Các yếu tố môi trƣờng đƣợc theo dõi 2 lần/ngày ở 8 giờ sáng và 16 giờ chiều. Các giá trị theo dõi bao gồm nhiệt độ, oxy hòa tan, NH3, NH4. Trong thời gian thí nghiệm thay nƣớc định kỳ 7 ngày/ lần, thay 25% nƣớc nhằm hạn chế nhiệt độ trong nƣớc biến động lớn. Thu mẫu đƣợc chia làm 5 đợt ở thí nghiệm ngắn ngày (14 ngày) bao gồm các thời điểm 0 giờ, 24 giờ, 96 giờ, 7 ngày và 14 ngày và thí nghiệm dài hạn 56 ngày thu ở ngày 28 và ngày 56.
Dùng vợt nhanh chóng thu 03 cá/bể thí nghiệm và tiên hành thu mẫu máu cá. Công việc đƣợc thực hiện cùng thời điểm vào buổi sáng (7:30 đến 10:30) trong vòng 5 phút. Việc thu mẫu cá bao gồm cân cá, rút máu và đo chiều dài. Máu đƣợc thu bằng bơm kim tiêm 1ml đã tráng qua Heparin. Lƣợng máu thu khoảng 0,3-0,5 ml/mẫu và đƣợc trữ tuýp nhựa 1,5 ml đƣợc ký hiệu riêng cho từng nghiệm thức. Mẫu đƣợc giữ lạnh trên nƣớc đá trong suốt thời gian lấy mẫu. Sau khi thu máu cá xong, tiến hành li tâm 10 phút (4020 vòng/phút) để thu huyết tƣơng. Huyết tƣơng đƣợc trữ trong tủ đông -80°C cho đến khi phân tích mẫu.
2.3.Phƣơng pháp phân tích 2.3.1. Phƣơng pháp đo cortizol
Nồng độ hormone cortisol trong huyết tƣơng đƣợc định lƣợng bởi phƣơng pháp miễn dịch men (ELISA-Enzyme-linked immunosorbent assay),
bằ (Đức). Tiến hành trên
đĩa 96 giếng đã đƣợc tráng kháng thể, .
- Quyết định số lƣợng giếng sẽ đƣợc thực hiện.
25
- Sau đó, tiếp tục cho 200 µL dung dịch Enzyme Conjugate vào các giếng trên và trộn đều trong 10 giây.
- Ủ 60 phút ở nhiệt độ phòng.
- Trút bỏ hết dung dịch có trong các giếng, rửa sạch 3 lần bằng dung dịch rửa (Wash Solution). Lần rửa sau cùng, trút bỏ hoàn toàn nƣớc đọng lại trong mỗi giếng cho thật khô.
- Tiếp tục thêm vào mỗi giếng 100 µL dung dịch Substrate và ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Cho 100 µL Stop Solution vào mỗi giếng để kết thúc các phản ứng của emzyme.
- Cuối cùng, đọc kết quả ở độ hấp thụ 450 nm trong vòng 10 phút kể từ lúc cho dung dịch Stop Solution vào.
2.3.2. Phƣơng pháp đo ion Na+ và K+
Đonồng độ ion Na+, K+ bằng máy Model 420 Flame Photometer ( hãng Sherwood), phƣơng pháp đo đƣợc thực hiện theo quy trình chuẩn tại Bộ môn Dinh dƣỡng và Chế biến thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
2.3.3. Phƣơng pháp đo áp suất thẩm thấu
Đo áp suất thẩm thấu bằng máy Fiske One-Ten Osmometer.
Dùng micropipet hút 15µl mẫu cho vào tuýp chuyên dụng và đƣợc xác định theo nguyên tắc hạ độ băng điểm, phƣơng pháp đo đƣợc thực hiện theo quy trình chuẩn tại Bộ môn Dinh dƣỡng và Chế biến thủy sản, Khoa Thủy Sản, Trƣờng Đại Học Cần Thơ.
2.3.4. Phƣơng pháp đo Glucose
Nguyên lý: đƣờng đƣợc chuyển đổi thành glucose peroxide bởi enzyme
glucose oxidase. Glucose peroxide tác dụng với ABS nhờ sự xúc tác của một loại enzyme khác là peroxidase để chuyển thành hợp chất màu xanh có thể đọc
26
ở bƣớc sóng 436 nm. Phƣơng pháp đo nồng độ đƣờng này để đánh giá trạng thái sinh lý của động vật dƣới điều kiện sinh vật bị stress.
Các dung dịch cần có để đo glucose trong huyết tƣơng cá:
- Phosphate buffer (0,6M): gồm 28,36 g Na2HPO4 (PM = 141,96), 13,625 g KH2PO4 (PM = 136,09) và hòa tan trong 500 mL nƣớc cất; rồi chỉnh pH sang 7,5, trữ ở nhiệt độ phòng để sử dụng.
- Phosphate buffer (0,1M): 100 mL Phosphate buffer (0,6M) đƣợc hòa tan trong 500 mL nƣớc cất, rồi chỉnh pH sang 7,5.
- Perchloric acid (0,33M): gồm 97,165 mL nƣớc cất và 2,835 mL HCLO4 (70%).
- Glucose hòa tan (1 g/L): gồm 20 mg glucose và 20 mL nƣớc cất. - Dung dịch phản ứng:
o 2000 đơn vị glucose oxidase (nếu 148.400 đơn vị/g, hòa tan 13,4 mg bột)
o 147 đơn vị peroxidise (nếu 113 đơn vị/mg, hòa tan 1,3 mg bột) o 125 mg ABTS (2,2 Azino-di-(3-ethylbenzoline sulfonate)) Hòa tan toàn bộ trong 500 mL dd đệm phosphate 0,1M.
Để dung dịch nơi tối,bao quanh giấy nhôm (enzyme nhạy ánh sáng); và đƣợc pha mới mỗi lần sử dụng.
Các bƣớc tiến hành:
- Dung dịch xây dựng đƣờng chuẩn:
Dung dịch chuẩn Glucose hòa tan (μL) Nƣớc cất (μL) Perchloric acid (μL)
S0 0 100 200 S1 5 95 200 S2 10 90 200 S3 20 80 200 S4 40 60 200 S5 60 40 200
27
S6 80 20 200
S7 100 0 200
- Loại protein: dùng microtube lấy 25 µL huyết thanh/chuẩn, 50 µL perchloric acid, trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút.
Hình 12. Máy ly tâm
- Đo đạt: cho vào tuýp nhựa 25 µL dịch nổi của mẫu hoặc chuẩn, 2 mL thuốc thử, trộn đều rồi ủ ở 38°C trong 15 phút. Rồi dùng máy quang phổ so màu để đọc kết quả ở bƣớc song 436nm.
28
Hình 14. Đọc kết quả bằng máy quang phổ so màu.
- Tính toán: đƣờng chuẩn glucose có hình cong. Điểm hấp phụ của mẫu đƣợc quy ra từ phƣơng trình đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp hồi quy tuyến tính.