3 .2.5 ng c và thiết bị máy móc
3.3.2 Phương pháp xét nghiệm
Ki m tra kháng th kháng virus cúm gia cầm ở các mẫu máu sau khi lấy ở các thời đi m bằng phương pháp xét nghiệm HI
Cách tiến hành phản ứng HI
Chuẩn bị hồng cầu gà 10% và 0,5%; chọn 2-3 con gà khỏe mạnh (từ những con không có bệnh cúm và không có tiêm phòng vaccine cúm gia cầm).
Lấy máu khoảng 4 – 5 ml có chất kháng đông (Alsever). Thêm một lượng tương đương dung dịch nước muối sinh lý vào phần máu vừa lấy, lắc đều. Ly tâm ở 2000 vòng trong 10 phút, loại bỏ phần nước phía trên và ly tâm lặp lại từ 2-3 lần.
Dùng Hematocrit đ đo tỷ lệ hồng cầu sau khi đã được rửa sạch. Pha hồng cầu 10% theo công thức C1V1=C2V2
Trong đó, C1 nồng độ hồng cầu gốc V1 th tích hồng cầu gốc
C2 nồng độ hồng cầu cần pha V2 th tích hồng cầu cần pha
Từ hồng cầu 10% pha hồng cầu 0,5% theo công thức trên đ làm phản ứng.
Chuẩn độ kháng nguyên cúm gia cầm bằng phản ứng HA Cho 50 µl PBS vào hai hàng A và B của đĩa phản ứng 96 giếng. Cho 50 µl kháng nguyên vào giếng A1 và B1.
Dùng micropipette trộn đều sau đó pha loãng dần từ giếng A1, B1 cho đến giếng A12,B12 với th tích là 50 µl, loại bỏ 50 µl dung dịch sau khi pha loãng đến giếng cuối cùng.
Thêm 50 µl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả các giếng, ủ ở nhiệt độ 40 Hình 3.2 Lấy máu tim ở gà 1 ngày tu i Hình 3.3 Lấy máu tỉnh mạch cánh gà lớn
Đọc kết quả hiệu giá của kháng nguyên (một đơn vị kháng nguyên) là độ pha loãng cao nhất có 100% hồng cầu gà ngưng kết.
Chuẩn bị mẫu huyết thanh làm phản ứng HI
Mẫu huyết thanh sau khi chắt xong tiến hành xử lý nhiệt ở 560
C trong 30 phút.
Sử dụng hồng cầu gà 10% đ hấp thụ những yếu tố làm ức chế quá trình thực hiện phản ứng HI, cách thực hiện như sau
Cho 90 µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Cho 30 µl mẫu huyết thanh đã xử lý nhiệt vào đĩa phản ứng. Cho 10 µl hồng cầu gà 10% vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Lấy phần huyết thanh trong ở phía trên đ làm phản ứng HI.
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu HI
Nguyên lý một số loại virus như virus cúm gia cầm, virus Newcastle có đặc tính gây ngưng kết hồng cầu ở một số loài gia súc, gia cầm. khi gặp kháng th đặc hiệu tương ứng thì virus sẽ bị kháng th trung hòa, không còn virus đ tiếp xúc với hồng cầu, do đó kháng th đã ức chế gây ngưng kết hồng cầu của virus. Ngược lại, nếu virus không gặp kháng th đặc hiệu tương ứng, virus sẽ không bị trung hòa bởi kháng th và sẽ gây ngưng kết hồng cầu.
Tiến hành phản ứng HI:
Cho 25 µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng 96 giếng. Cho 25 µl huyết thanh đã được hấp phụ vào giếng thứ nhất, trộn đều, hút 25 µl cho sang giếng thứ hai, làm tiếp tục như vậy cho đến giếng thứ 9, hút bỏ 25 µl.
Cho 25 µl kháng nguyên bốn đơn vị vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, lắc đều, đều ở 40C trong 30 phút cho kháng th hiện diện trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên.
Cho vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 0,5%, lắc đều, sau đó đ ở 40C trong 45 phút cho đến khi hồng cầu trong giếng đối chứng tụ lại thành cụm tròn nhỏ ở đáy giếng.
Thực hiện phản ứng đối chứng giếng thứ 10 và 11 đ làm đối chứng âm và đối chứng dương, thực hiện tương tự như các mẫu huyết thanh ki m tra nhưng thay vào đó bằng huyết thanh âm tính và dương tính chuẩn, giếng thứ 12 làm đối chứng hồng cầu 25 µl dung dịch PBS và 25 µl hồng cầu gà 0,5%.
Bảng 3.1 Trình tự thực hiện phản ứng HI Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (ĐCÂ) 11 (ĐCD) 12 (ĐCHC) PBS (µ) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Huyết thanh (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Kháng nguyên (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Đ ở 40 C trong 30 phút Hồng cầu gà (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Đ ở 40 C trong 30 phút
Cho 25µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng 96 giếng. Cho 25 µl huyết thanh đã được hấp phụ vào các giếng của hai hàng A và B của đĩa phản ứng (hàng A làm đối chứng huyết thanh, hàng B làm phản ứng).
Dùng micropipette pha loãng mẫu huyết thanh bắt đầu từ hàng H với th tích là 25 µl, loại bỏ 25 µl sau khi pha loãng đến hàng cuối cùng của đĩa phản ứng.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Cho 50 µl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Ủ ở nhiệt độ 40C trong 45 phút tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả
Phản ứng dương tính khi hồng cầu tụ thành chấm đỏ ở dưới đáy giếng, giếng đối chứng hồng cầu. hiệu giá kháng th kháng virus cúm gia cầm trong mẫu huyết thanh là độ pha loãng cao nhất của mẫu huyết thanh có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu gà 100%.
Phản ứng âm tính hồng cầu xuất hiện từng cụm ngưng kết ở đáy giếng.
Kết luận
Mẫu huyết thanh được xem là có kháng th kháng virus cúm gia cầm (dương tính) khi có hiệu giá kháng th ≥ 1/8 – Subtype dương tính tùy thuộc vào kháng nguyên sử dụng trong phản ứng.
Tiêu chí đánh giá
Hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá th gia cầm ; đàn gia cầm được bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá th có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2). Theo qui định của Cục Thú y, Bộ Nông nghiệp và PTNT tại công văn số 1361/CTY-DT ngày 02/12/2005 của Cục Thú y về Hướng dẫn giám sát sau tiêm phòng vaccin cúm gia cầm th độc lực cao giai đoạn I 2005-2006.
Hiệu giá kháng th trung bình (GMT)
Được tính theo công thức GMT = Antilog log10 (mshg) / n] Trong đó
mshg Mẫu số hiệu giá của mẫu dương tính n T ng số mẫu xét nghiệm
GMT: Geometric mean titer