Tại Việt Nam, bệnh cúm gia cầm xảy ra vào cuối năm 2003 đầu năm 2004 làm trên 40 triệu gia cầm bị tiêu huỷ, gây thiệt hại nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi gia cầm và ảnh hưởng lớn đến sức khỏe con người. Dự đoán trong nhiều năm nữa, bệnh vẫn là mối đe dọa nguy hi m cho sự phát tri n của ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta và cho sức khỏe cộng đồng. Theo khuyến cáo của T chức dịch tễ
vaccine có th làm tăng ngưỡng nhiễm mầm bệnh và hạn chế sự lây lan của virus từ gia cầm sang gia cầm và từ gia cầm sang người.
Tuy nhiên, trước đó chúng ta không hề biết tình hình nhiễm cúm gia cầm trên đàn gia cầm ở nước ta. Việc quan sát cho thấy thủy cầm cũng mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 lại một lần nữa khẳng định thủy cầm không chỉ là vật lưu giữ virus cúm, mà khi bị nhiễm đã phát bệnh nặng.
Đ phòng chống virus cúm gia cầm H5N1, cuối năm 2005, Bộ Nông nghiệp và Phát tri n nông thôn đã cho phép nhập khẩu vaccine vô hoạt cúm gia cầm chủng H5N1 của Trung Quốc. Việt Nam là một trong số các nước trên thế giới đã tiến hành đồng bộ các biện pháp như tiêu hủy đàn gia cầm, cấm lưu thông tiêu thụ gia cầm và sản phẩm gia cầm, ki m soát giết m và các biện pháp an toàn sinh học… Mặc dù những biện pháp này đã cho hiệu quả nhất định song rất tốn kém, gây thiệt hại lớn về kinh tế và kết quả khống chế bệnh thấp. Vì thế, song song với việc áp dụng các biện pháp đồng bộ khác thì việc sử dụng vaccine được xem như một biện pháp hỗ trợ trong việc phòng và hạn chế bệnh cúm gia cầm.
Một nghiên cứu khác của Nguyễn Tiến Dũng (2005), chủng virus H5N1 không những có mặt ở các đàn gà mà còn gây bệnh cho vịt và ngan. Sau khi nhiễm, cá th vịt bài thải virus H5N1 đến 17 ngày sau đó và ở đàn vịt 500 con thì virus bài thải ra môi trường bên ngoài tới 35 ngày sau khi cá th đầu tiên bị bệnh; gà có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 8 lần nếu nuôi chung với vịt.
Năm 2004, toàn tỉnh Bạc Liêu có 6 huyện, thị xã có dịch, với t ng số gia cầm bị tiêu huỷ là 797.104 con (gà 126.126 con, vịt 670.978 con). Năm 2005, toàn tỉnh có 6/6 huyện, thị xã có dịch, với t ng số gia cầm bị tiêu huỷ là 159.895 con trong đó gà 1.099 con, vịt 158.796 con. Kết quả tiêm phòng vaccine H5N2 cho gà và H5N1 cho vịt đạt từ 67,33% đến 92,45% ở gà, từ 80,47 đến 92,35% ở vịt. Kết quả xét nghiệm 121 mẫu huyết thanh gà và 439 mẫu huyết thanh vịt bằng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) năm 2005 cho thấy tỷ lệ bảo hộ trên gà từ 20% đến 88,89%, tỷ lệ bảo hộ trên vịt từ 13,33% đến 100%. Năm 2006 khảo sát 91 mẫu huyết thanh gà và 149 mẫu huyết thanh vịt. Kết quả tỷ lệ bảo hộ trên gà từ 76,67% đến 86,67%, tỷ lệ bảo hộ trên vịt từ 90% đến 100% (Nguyễn Thị Thanh Tâm, 2006).
- Năm 2005 ki m tra huyết thanh trên 12 đàn vịt thuộc 4 huyện, thị, thành Long Xuyên, Châu Thành, Chợ Mới và Châu Đốc với 360 mẫu huyết thanh tỷ lệ bảo hộ đạt từ 79,31%- 90%.
Tháng 12/2007, Nguyễn Thế Tĩnh, (2007) đã khảo sát khả năng đáp ứng miễn dịch vaccine phòng cúm gia cầm tỉnh Thái Nguyên khi ki m tra 1.560 mẫu huyết thanh ở gà và vịt, có 951 mẫu có hiệu giá kháng th từ 4log2 trở lên bằng 61%, thấp hơn so với kết quả thử nghiệm của Trung Quốc và phòng dịch tễ Cục Thú y (2007). Chỉ có 25/52 đàn có hiệu giá HI đạt mức bảo hộ bằng 48,1%, trong đó 19/34 đàn gà bằng 55,9%, 6/18 đàn vịt bằng 33,3%. So với kết quả ki m tra của Bộ NN và PTNT năm 2007 ở một số địa phương là > 50%, tỷ lệ bảo hộ ở gia cầm nhỏ hơn 5 tuần tu i là 9/28 đàn (32,1%), và lớn hơn 5 tuần tu i là 16/24 đàn (66,7%). Như vậy việc tiêm phòng cúm cho đàn gia cầm chưa đạt mức bảo hộ cần thiết vì theo Tô Long Thành (2007), nếu tỷ lệ hiệu giá HI đạt mức bảo hộ trong đàn ≥ 70% thì mới được coi là có khả năng bảo hộ.
Hiệu giá kháng th trên đàn gia cầm sau khi tiêm vaccine cúm phụ thuộc vào loài gia cầm và phương thức chăn nuôi. Nghiên cứu của Lưu Đình Lệ Thuý, (2008) tại Bình Dương thì tỷ lệ bảo hộ sau tiêm phòng tính chung của các đàn gia cầm là 66,15% ở lần ki m tra thứ nhất, sau 4 tháng giảm còn 53,69 %. Gà ở hộ chăn nuôi nhỏ lẻ, vịt và cút không đủ bảo hộ đối với bệnh. Gà đẻ nuôi công nghiệp có tỷ lệ bảo hộ rất tốt (89,85- 94,06% có hiệu giá kháng th ≥ 4log2).
Nghiên cứu của Trịnh Thị Quý và cs (2010), cho biết hiệu giá kháng th trung bình, tỷ lệ bảo hộ của đàn gà được tiêm vaccine H5N1 tại tỉnh Phú Thọ tăng dần và đạt mức cao nhất tại thời đi m 60 ngày sau khi tiêm 5,31 log2, tỷ lệ bảo hộ đạt 86,67%. Tại những thời đi m sau đó; hiệu giá kháng th , tỷ lệ bảo hộ của đàn gà giảm dần và đạt mức thấp nhất tại thời đi m sau tiêm phòng 150 ngày 3,59 log2, tỷ lệ bảo hộ đạt 31,9%.
Mẫu huyết thanh của gia cầm đã được ki m tra đáp ứng miễn dịch sau tiêm vaccine NIBRG-14, HI, bằng cách sử dụng kháng nguyên H5N1 (A/chicken/Scotland/59. Hai tuần sau liều tiêm đầu tiên 76,6% số gà đã phát hiện phản ứng HI chống lại virus vaccin với giá trị GMT từ 3,7-4,4 log2. Tuy nhiên 3 tuần sau liều tiêm thứ 2, 100% gà có kháng th HI với GMT từ 6,2-6,7 log2 (Đậu Huy Tùng, 2012).
Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI N CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu
(1) Khảo sát kháng th thụ động ở gà con 1 ngày tu i và 13 ngày tu i.
(2) Ki m tra đáp ứng miễn dịch của 2 giống gà qua thử nghiệm 2 qui trình tiêm phòng 1 lần lúc 14 ngày tu i và 2 lần lúc 14 ngày tu i và lặp lại lúc 28 ngày tu i.
(3) So sánh đáp ứng miễn dịch ở hai qui trình tiêm phòng trên 2 giống gà
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian nghiên cứu: tháng 01/2013 đến tháng 06/2013. Địa đi m nghiên cứu
Phân tích mẫu tại Cơ Quan Thú Y Vùng VII
Gà thí nghiệm được nuôi tại Trại gà Ba Hoàng ở t 7, khu vực Thới Thạnh, phường Thới An Đông, Q.Bình Thủy, TP.Cần Thơ
3.2.2 Đối tượng nghiên cứu
Gà nuôi thí nghiệm Gà con từ 1 ngày tu i ở 2 giống gà, gà Lương Phượng, gà Nòi. Trọng lượng gà mỗi giống đồng đều nhau.
Nguồn gốc gà con
+ Gà Nòi Trại gà Hai Két ở ấp 1, xã Thạnh Hòa, huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang
+ Gà Lương Phượng Trại gà Hai On, phường 1, TP. Vĩnh Long, tỉnh Vĩnh Long
3.2.3 ật liệu thí nghiệm
- Huyết thanh gà con 1 ngày tu i và 13 ngày tu i của 2 giống gà được ấp nở từ đàn gà bố mẹ đã được tiêm phòng vaccine cúm gia cầm vô hoạt H5N1.
- Huyết thanh gà tiêm phòng 1 mũi vào lúc 14 ngày tu i sẽ được lấy vào các thời đi m gà 35 ngày, 65 ngày, 95 ngày và 125 ngày tu i.
- Huyết thanh gà tiêm phòng mũi một vào lúc 14 ngày tu i và lặp lại lúc 28 ngày tu i sẽ được lấy vào các thời đi m gà 35 ngày, 65 ngày, 95 ngày và 125 ngày tu i.
3.2.4 Hóa chất và sinh phẩm
- Vaccin do Trung Quốc sản xuất Reassortan Avian Influenza virus vaccine, Inactivated (H5 Subtype, Re-5 Strain), chế từ chủng DK/AH/06 (phân lập trên vịt ở An Huy)
- Kháng nguyên chuẩn vô hoạt H5N1/UK- Anh Quốc - Hồng cầu gà 10%, 0,5%
Hóa chất
- Dung dịch chống đông Alsever - PBS (Phosphate Buffer Saline) - Nước muối sinh lý 0,85% - Cồn 70o
- Nước cất vô trùng
3.2.5 ng c và thiết bị máy móc
Dụng cụ
- Các dụng cụ lấy mẫu ống tiêm nhựa 1ml, 5ml, thùng đựng mẫu, túi nylon, nhãn dán, bông…
- Tube eppendorf nhựa 1,5 ml - Máng nhựa
- Micropipette 100 µl, 1 ml - Micropipette nhiều đầu - Đầu cone...
Thiết bị máy móc - Tủ đông – 20oC - Tủ ấm 37oC
- Máy ly tâm thường
- Máy ly tâm nhỏ (microcentrifuge) - Nồi hấp autoclave
3.3 Phương pháp thí nghiệm
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản huyết thanh
- Phương pháp lấy máu gà
Lấy máu gà con vị trí lấy máu ở tim. Một người cố định gà nằm ngửa, một tay giữ mỏ, tay kia giữ 2 chân. Dùng cồn 70o
sát trùng vị trí ức gà. Người lấy máu dùng ngón trỏ xác định vị trí tim đập, dùng bơm tiêm 1ml rút lấy khoảng 0,3 – 0,5 ml máu, hướng bơm tiêm song song với thân gà ( hình 3.2).
Lấy máu gà lớn một tay giữ 2 cánh ở phía trên, sát trùng cồn 70o và bộc lộ tĩnh mạch, một tay dùng bơm tiêm 5ml rút lấy máu tĩnh mạch cánh 1 – 2 ml máu . Kéo xylanh về vạch 4-5 ml. Dùng pen bẻ quặp đầu kim. Đặt bơm tiêm nằm ngang cho máu đông khoảng 20 phút, đ vào túi nylon, dán nhãn sau đó cho vào thùng trữ mẫu.
- Bảo quản mẫu
Máu sau khi lấy sẽ được trữ lạnh ở trong thùng trữ mẫu rồi chuy n đến phòng thí nghiệm, chắt lấy huyết thanh cho vào ống eppendorf, gắn nhãn và trữ trong tủ lạnh ở -20o C chờ xét nghiệm.
3.3.2 Phương pháp xét nghiệm
Ki m tra kháng th kháng virus cúm gia cầm ở các mẫu máu sau khi lấy ở các thời đi m bằng phương pháp xét nghiệm HI
Cách tiến hành phản ứng HI
Chuẩn bị hồng cầu gà 10% và 0,5%; chọn 2-3 con gà khỏe mạnh (từ những con không có bệnh cúm và không có tiêm phòng vaccine cúm gia cầm).
Lấy máu khoảng 4 – 5 ml có chất kháng đông (Alsever). Thêm một lượng tương đương dung dịch nước muối sinh lý vào phần máu vừa lấy, lắc đều. Ly tâm ở 2000 vòng trong 10 phút, loại bỏ phần nước phía trên và ly tâm lặp lại từ 2-3 lần.
Dùng Hematocrit đ đo tỷ lệ hồng cầu sau khi đã được rửa sạch. Pha hồng cầu 10% theo công thức C1V1=C2V2
Trong đó, C1 nồng độ hồng cầu gốc V1 th tích hồng cầu gốc
C2 nồng độ hồng cầu cần pha V2 th tích hồng cầu cần pha
Từ hồng cầu 10% pha hồng cầu 0,5% theo công thức trên đ làm phản ứng.
Chuẩn độ kháng nguyên cúm gia cầm bằng phản ứng HA Cho 50 µl PBS vào hai hàng A và B của đĩa phản ứng 96 giếng. Cho 50 µl kháng nguyên vào giếng A1 và B1.
Dùng micropipette trộn đều sau đó pha loãng dần từ giếng A1, B1 cho đến giếng A12,B12 với th tích là 50 µl, loại bỏ 50 µl dung dịch sau khi pha loãng đến giếng cuối cùng.
Thêm 50 µl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả các giếng, ủ ở nhiệt độ 40 Hình 3.2 Lấy máu tim ở gà 1 ngày tu i Hình 3.3 Lấy máu tỉnh mạch cánh gà lớn
Đọc kết quả hiệu giá của kháng nguyên (một đơn vị kháng nguyên) là độ pha loãng cao nhất có 100% hồng cầu gà ngưng kết.
Chuẩn bị mẫu huyết thanh làm phản ứng HI
Mẫu huyết thanh sau khi chắt xong tiến hành xử lý nhiệt ở 560
C trong 30 phút.
Sử dụng hồng cầu gà 10% đ hấp thụ những yếu tố làm ức chế quá trình thực hiện phản ứng HI, cách thực hiện như sau
Cho 90 µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Cho 30 µl mẫu huyết thanh đã xử lý nhiệt vào đĩa phản ứng. Cho 10 µl hồng cầu gà 10% vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Lấy phần huyết thanh trong ở phía trên đ làm phản ứng HI.
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu HI
Nguyên lý một số loại virus như virus cúm gia cầm, virus Newcastle có đặc tính gây ngưng kết hồng cầu ở một số loài gia súc, gia cầm. khi gặp kháng th đặc hiệu tương ứng thì virus sẽ bị kháng th trung hòa, không còn virus đ tiếp xúc với hồng cầu, do đó kháng th đã ức chế gây ngưng kết hồng cầu của virus. Ngược lại, nếu virus không gặp kháng th đặc hiệu tương ứng, virus sẽ không bị trung hòa bởi kháng th và sẽ gây ngưng kết hồng cầu.
Tiến hành phản ứng HI:
Cho 25 µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng 96 giếng. Cho 25 µl huyết thanh đã được hấp phụ vào giếng thứ nhất, trộn đều, hút 25 µl cho sang giếng thứ hai, làm tiếp tục như vậy cho đến giếng thứ 9, hút bỏ 25 µl.
Cho 25 µl kháng nguyên bốn đơn vị vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng, lắc đều, đều ở 40C trong 30 phút cho kháng th hiện diện trong huyết thanh liên kết với kháng nguyên.
Cho vào mỗi giếng 25 µl hồng cầu gà 0,5%, lắc đều, sau đó đ ở 40C trong 45 phút cho đến khi hồng cầu trong giếng đối chứng tụ lại thành cụm tròn nhỏ ở đáy giếng.
Thực hiện phản ứng đối chứng giếng thứ 10 và 11 đ làm đối chứng âm và đối chứng dương, thực hiện tương tự như các mẫu huyết thanh ki m tra nhưng thay vào đó bằng huyết thanh âm tính và dương tính chuẩn, giếng thứ 12 làm đối chứng hồng cầu 25 µl dung dịch PBS và 25 µl hồng cầu gà 0,5%.
Bảng 3.1 Trình tự thực hiện phản ứng HI Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (ĐCÂ) 11 (ĐCD) 12 (ĐCHC) PBS (µ) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 Huyết thanh (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Độ pha loãng 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Kháng nguyên (µl) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Đ ở 40 C trong 30 phút Hồng cầu gà (µl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 Đ ở 40 C trong 30 phút
Cho 25µl PBS vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng 96 giếng. Cho 25 µl huyết thanh đã được hấp phụ vào các giếng của hai hàng A và B của đĩa phản ứng (hàng A làm đối chứng huyết thanh, hàng B làm phản ứng).
Dùng micropipette pha loãng mẫu huyết thanh bắt đầu từ hàng H với th tích là 25 µl, loại bỏ 25 µl sau khi pha loãng đến hàng cuối cùng của đĩa phản ứng.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
Cho 50 µl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả các giếng của đĩa phản ứng. Ủ ở nhiệt độ 40C trong 45 phút tiến hành đọc kết quả.
Đọc kết quả
Phản ứng dương tính khi hồng cầu tụ thành chấm đỏ ở dưới đáy giếng, giếng đối chứng hồng cầu. hiệu giá kháng th kháng virus cúm gia cầm trong mẫu huyết thanh là độ pha loãng cao nhất của mẫu huyết thanh có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầu gà 100%.
Phản ứng âm tính hồng cầu xuất hiện từng cụm ngưng kết ở đáy giếng.
Kết luận
Mẫu huyết thanh được xem là có kháng th kháng virus cúm gia cầm (dương tính) khi có hiệu giá kháng th ≥ 1/8 – Subtype dương tính tùy thuộc vào kháng nguyên sử dụng trong phản ứng.
Tiêu chí đánh giá
Hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá th gia cầm ; đàn gia cầm được bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá th có hiệu giá HI ≥ 1/16 (4log2). Theo qui định của Cục Thú y, Bộ Nông nghiệp và PTNT tại công văn số 1361/CTY-DT ngày 02/12/2005 của Cục Thú y về Hướng dẫn giám sát sau tiêm phòng vaccin cúm gia cầm th độc lực cao giai đoạn I 2005-2006.
Hiệu giá kháng th trung bình (GMT)
Được tính theo công thức GMT = Antilog log10 (mshg) / n]