Trong quá trình nghiên cứu tại thực địa, chúng tơi đã thu thập được 5
mẫu quả sa nhân, kí hiệu: M l, M2, M3, M4, M5, trong đĩ M l là mẫu quả lồi sa nhân SMI ( Amomum ovoideum Pierre ). Sau đây là kết quả nghiên cứu về hố học các mẫu quả sa nhân này.
3.2.1. Định tính các nhĩm chất hố học cĩ trong vỏ quả sa nhân:
Mẫu quả sa nhân M I thu hái vào tháng 7/2002 được tách riêng vỏ và hạt. Lấy riêng phần vỏ, sấy khơ, nghiền thơ. Bột dược liệu được sử dụng thực hiện các phản ứng định tính.
3.2.1.1Đ ịnh tính alcaỉoid:
Cho 5 g bột dược liệu vào bình nĩn dung tích 250 ml, thêm 30 ml dung dịch H2S 0 4 3%, đun đến sơi, để nguội, lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml. Kiềm hố dịch lọc bằng dung dịch NH4OH 6 N đến khi thử giấy quì cho phản ứng kiềm. Lắc dịch lọc với cloroform 3 lần, mỗi lần 10 ml. Gộp dịch chiết cloroform. Cho vào 3 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch chiết cloroform. Bốc hơi cách thuỷ đến khi đáy ống nghiệm cịn cắn khơ. Cho lần lượt vào 3 ống nghiệm trên mỗi ống 1 ml dung dịch H2S 0 4 3%, lắc đều cho tan hết cắn, nhỏ vào mỗi ống 3 giọt thuốc thử:
* Ống 1: Thuốc thử Mayer khơng thấy xuất hiện tủa trắng.
* Ơng 2: Thuốc thử Dragendorff khơng thấy xuất hiện tủa đỏ gạch. * Ống 3: Thuốc thử Bouchardat khơng thấy xuất hiện tủa nâu.
( Phản ứng âm tính)
> N hận xét:Tìr kết quả định tính trên, sơ bộ nhận định trong dược liệu
khơng chứa alcaloid.
3.2.1.2. Định tính saponin:
* Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Lấy khoảng 5 g dược liệu, chiết bằng cồn nĩng. Để nguội, lọc lấy dịch chiết cồn. Cho 10 giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm dung tích 20 ml thêm
chứa 5 ml nước. Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc của ống. Quan sát thấy cĩ lớp bọt, bền trong khoảng 15 phút.
( Phản ứng dương tính ) * Hiện tượng phá huyết:
Trên một lam kính khơ, sạch, nhỏ một giọt máu bị đã loại fibrin. Đậy lá kính lên, soi kính hiển vi thấy các tế bào hồng cầu hình đĩa cịn nguyên vẹn. Sau đĩ nhỏ lên cạnh lá kính 1 giọt dịch chiết cồn dược liệu. Sau 1 phút quan sát trên kính hiển vi thấy một số tế bào hồng cầu bị vỡ.
( Phản ứng dương tính)
> Nhận xét: Qua các hiện tượng trên cĩ thể kết luận sơ bộ dược liệu
cĩ chứa saponin.
3.2.1.3. Định tính flavonoid:
Cho 5g bột dược liệu vào bình nĩn dung tích 100ml, thêm 50ml ethanol 90°. Đun sơi cách thuỷ trong 5 phút, lọc nĩng, đem cơ cách thuỷ dịch lọc cịn
10ml, dịch này để thử các phản ứng sau: * Phản ứng Cyanidin:
Cho 2 ml dịch chiết dược liệu vào 1 ống nghiệm nhỏ, thêm một ít bột Mg kim loại và 5 giọt HC1 đặc. Để yên 5 phút thấy dung dịch chuyển thành màu đỏ cam.
( Phản ứng dương tính) Phản ứng với kiềm:
Cho vào 1 ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết, thêm 3 -5 giọt dung dịch NaOH 10% thấy trong ống nghiệm cĩ tủa vàng xuất hiện. Thêm vào ống nghiệm 1 ml nước cất thấy màu vàng tăng lên .
( Phản ứng dương tính) Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%:
Cho vào 1 ống nghiêm nhỏ 2 ml dịch chiết dược liệu, thêm vào 2-3 giọt dung dịch FeCl3 5% thấy dung dịch xuất hiện kết tủa màu xanh đen.
( Phản ứng dương tính)
> Nhận xét: Từ các phản ứng trên cĩ thể kết luận sơ bộ dược liệu cĩ
3.2.1.4. Định tính anthranoid:
Phản ứng Bomtrager:
Cho 3g bột dược liệu vào bình nĩn dung tích 100ml, thêm 20ml dung dịchH 2S 0 4 10%. Đun sơi cách thuỷ 15 phút. Lọc dịch lọc cho vào bình gạn lắc với 50ml ether ethylic trong 1-2 phút. Để yên cho tách thành 2 lớp, gạn lấy lớp ether ethylic, thêm 3ml dung dịch NaOH 10% khơng thấy lớp nước xuất hiện màu đỏ sim.
( Phản ứng âm tính) Phản ứng vi thăng hoa:
Cho một ít bột dược liệu vào trong một nắp chai bằng kim loại. Hơ nhẹ trên bếp lửa đèn cồn cho hơi nước bay hết. Đậy một lam kính lên trên, phía trên lam kính cĩ phủ một lớp bơng ướt. Đặt nắp chai lên bếp đèn cồn trong 2 phút. Lấy lam kính xuống, để nguội, quan sát qua kính hiển vi khơng thấy cĩ tinh thể chất thăng hoa.
( Phản ứng âm tính)
> N hận xét: Qua các phản ứng trên cĩ thể kết luận sơ bộ dược liệu
khơng chứa anthranoid.
3.2.1.5. Định tính coumarin:
Cho 5 g bột dược liệu vào bình nĩn dung tích 100 ml, thêm 20 ml
ethanol 96° đun cách thuỷ sơi trong vài phút. Để nguội, lọc dịch chiết qua giấy lọc. Dịch lọc được sử dụng thực hiện một số phản ứng sau:
* Phản ứng mở- đĩng vịng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ:
* Ống 1: 1 ml dịch chiết + 1 ml dung dịch NaOH 10%. * Ống 2: 1 ml dịch chiết.
Đun sơi cả 2 ống nghiệm trên, để nguội. Quan sát thấy: * Ống nghiệm 1 cĩ màu vàng đục.
Thêm vào mỗi ống nghiêm 2 ml nước cất, lắc mạnh. Quan sát thấy : * Ống nghiệm 1 trong suốt.
* Ống nghiệm 2 đục.
Thêm 5 giọt dung dịch HC1 đặc vào ống nghiệm 1. Quan sát thấy ống nghiệm 1 đục như ống nghiệm 2.
( Phản ứng dương tính) Phản ứng Diazo hố:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vào đĩ 2 ml dung dịch NaOH 10%, đun đến sơi rồi để nguội. Thêm vào ống nghiêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha. Quan sát thấy trong ống nghiệm xuất hiện tủa đỏ gạch.
( Phản ứng dương tính) * Phản ứng chuyển đồng phân cis - trans:
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy nhẹ đến khơ. Che một nửa vết chấm bằng đồng tiền kim loại. Soi dưới ánh sáng tử ngoại trong 5 phút, sau đĩ bỏ đồng tiền kim loại thấy phần khơng che sáng hơn. Tiếp tục chiếu ánh sáng tử ngoại thấy phần bị che sáng dần.
( Phản ứng dương tính)
'r Nhận xét: Qua các phản ứng trên cĩ thể sơ bộ kết luận trong dược liệu cĩ chứa coumarin.
3.2.1.6. Định tính tanin:
Cho 5 g bột dược liệu vào bình nĩn dung tích 100 ml. Thêm 20 ml nước cất. Đun sơi trong vài phút, lọc qua giấy lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau.
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm 2 giọt dung dịch FeCl35% thấy xuất hiện màu xanh đậm.
Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm 2 giọt dung dịch gelatin 1% thấy cĩ tủa bơng trắng.
( Phản ứng dương tính)
# Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%: Cho lm l dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm 2 giọt dung dịch chì acetat 10% xuất hiện kết tủa .
( Phản ứng dương tính)
> Nhận xét: Từ kết quả định tính trên, sơ bộ kết luận trong dược liệu
cĩ chứa tanin.
3.2.I.7. Định tính glycosid tim:
Cho lOg bột dược liệu vào bình nĩn 200ml, thêm 100 ml nước ngâm để qua đêm. Gạn dịch chiếtvào cốc cĩ mỏ, thêm vào dịch lọc 5 ml dung dịch chì acetat 30%, khuấy đều, để lắng, lọc qua giấy lọc loại tủa. Thử dịch lọc cho đến khi hết tủa, nếu cịn tủa tiếp tục cho thêm dung dịch chì acetat. Chuyển dịch lọc cho vào bình gạn dung tích 100 ml, lắc với cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml cloroform. Gạn lớp cloroform vào cốc cĩ mỏ, dịch lọc khơng được lẫn nước. Chia đều dịch lọc vào 3 ống nghiệm nhỏ, tiến hành cơ cách thuỷ đến khơ, cắn cịn lại đem thực hiện các phản ứng sau:
Phản ứng Liebermann:
Cho vào một ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid acetic. Lắc đều cho tan hết cặn, nghiêng thành ống nghiệm 45°, thêm đồng lượng H-,S04 đặc theo thành ống nghiệm . Phần tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng khơng thấy xuất hiện vịng màu tím đỏ, lắc nhẹ lớp trên khơng cĩ màu xanh.
( Phản ứng âm tính) % Phản ứng Baljet:
Cho vào một ống nghiệm chứa cắn 1 ml cồn 90°. Lắc hồ tan cắn. Thêm 3- 5 giọt thuốc thử Baljet mới pha. Quan sát khơng thấy trong ống nghiệm xuất hiện màu da cam.
% Phản ứng Keller- kiliani:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, nghiêng thành ống nghiệm 45°. Đổ từ từ đồng lượng H2S 0 4 đặc theo thành ống nghiệm. Quan sát khơng thấy xuất hiện vịng nâu đỏ phần tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng.
( Phản ứng âm tính)
> Nhận xét: Từ kết quả định tính trên, sơ bộ nhận định trong dược liệu
khơng cĩ glycosid tim.
3.2.1.8. Định tính phytosterol:
Lấy 20 g bột dược liệu cho vào túi giấy tiến hành chiết Soxhlet bằng dung mơi ether dầu hoả. Đổ 5 ml dịch chiết ether dầu hoả vào cốc cĩ mỏ. Thêm 3 ml dung dịch NaOH 10%, đun cách thuỷ đến khơ. Hồ tan cắn bằng 5 ml cloroform, lấy dịch cloroform thực hiện một số phản ứng định tính.
# Phản ứng Liebermann- Burchardt:
Cho 1 ml dịch cloroform vào ống nghiệm nhỏ, cơ cách thuỷ đến khơ, cắn cịn lại thêm 0,5 ml anhydrid acetic, lắc cho tan hết cắn. Nghiêng thành ống nghiệm 45°, thêm từ từ 1 ml dung dịch H0S 0 4 đặc theo thành ống nghiệm. Quan sát thấy phần tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng khơng xuất hiện màu tím đỏ.
( Phản ứng âm tính) * Phản ứng Salkowski:
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch cloroform, thêm từ từ theo thành ống nghiệm 1 ml dung dịch H2S 0 4 đặc. Quan sát thấy phần tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng khơng cĩ màu đỏ, lớp acid ở dưới khơng cĩ màu xanh.
( Phản ứng âm tính)
> Nhận xét: Qua các phản ứng trên cĩ thể sơ bộ kết luận dược liệu
khơng chứa phytosterol.
3.2.1.9. Định tính acid béo:
Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nĩn cĩ nút mài dung tích 50ml, thêm 30ml ether ngâm qua đêm, lọc, nhỏ 1 giọt dịch chiết ether lên giấy lọc, hơ
nĩng nhẹ để bay hơi hết ether ethylic. Quan sát thấy khơng cĩ vết mờ trên giấy lọc.
( Phản ứng âm tính)
> Nhận xét: Từ kết quả trên cĩ thể sơ bộ nhận định dược liệu khơng chứa chất béo.
3.2.1.10. Định tính acid hữu cơ:
Cho 5 g bột dược liệu vào bình nĩn dung tích 50 ml thêm 20 ml cồn, đun sơi cách thuỷ vài phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc. Cho 5 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài hạt tinh thể Na2C 0 3. Quan sát thấy cĩ bọt khí nổi lên.
( Phản ứng dương tính)
> Nhận xét: Từ kết quả trên cĩ thể sơ bộ kết luận dược liệu cĩ chứa acid hữu cơ.
3.2.1.11. Định tính đường khử:
Cho 5 g bột dược liệu vào bình nĩn dung tích 50 ml thêm 20 ml cồn, đun sơi cách thuỷ vài phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc. Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml thuốc thử Fehling B, đun sơi cách thuỷ 5 phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch.
( Phản ứng dương tính)
> N hận xét: Từ phản ứng trên cĩ thể kết luận sơ bộ dược liệu cĩ chứa đường khử.
3.2.1.12 Định tính acid amin:
Cho 5 g bột dược liệu vào bình nĩn dung tích 50 ml thêm 20 ml cồn, đun sơi cách thuỷ vài phút. Lọc dịch chiết qua giấy lọc. Cho 2 ml dịch lọc vào ống nghiệm thêm 5 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ 5 phút thấy xuất hiện màu tím.
( Phản ứng dương tính)
> N hận xét: Từ phản ứng trên cĩ thể kết luận sơ bộ dược liệu cĩ chứa
B ảng 3: Tĩm tắt kết quả định tính các nhĩm chất hố học cĩ trong vỏ quả M l. STT Nhĩm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Alkaloid 1 .Phản ứng TT Mayer 2.Phản ứng TT Bouchardat 3.Phản ứng TT Dragendorff - Khơng 2 Flavonoid 1 .Phản ứng Cyanidin 2.Phản ứng với kiềm 3.Phản ứng với dd FeCl3 5% ++ ++ +++ Cĩ
3 Saponin 1 .Hiện tượng tạo bọt
2.Hiện tượng phá huyết
+++ ++ Cĩ 4 Anthranoid 1 .Phản ứng Bomtrager 2.Phản ứng vi thăng hoa - Khơng 5 Coumarin 1 -Phản ứng mở đĩng vịng lacton 2.Phản ứng Diazo hố 3.Phản ứng chuyển đồng phân cis-trans + + + Cĩ 6 T anin 1 .Phản ứng với dd FeCl3 5% 2.Phản ứng với dd chì acetatl0% 3.Phản ứng với dd gelatin 1% +++ +++ +++ Cĩ 7 Glycosid 1 .Phản ứng Liebermann 2.Phản ứng Baljet 3.Phản ứng Keller-Kiliani - Khơng
8 Phytosterol 1 .Phản ứng Liebermann Burchardt
2.Phản ứng Salkowski
-
Khơng 9 Đường khử Phản ứng TT Fehling ( A+ B) +++ Cĩ 10 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Khơng 11 Acid hữu cơ Phản ứng với tinh thể Na2C 0 3 ++ Cĩ 12 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% ++ Cĩ
Ghi chú: - Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng dương tính khơng rõ. ++ Phản ứng dương tính rõ.
3.2.2. Xác định hàm lượng tinh dầu hạt:
Các mẫu quả sa nhân được thu hái vào tháng 7/2002, kí hiệu: M l, M2, M3, M4, M5, phơi khơ, bảo quản kỹ. Tách riêng phần vỏ quả và khối hạt, nghiền thơ khối hạt bằng thuyền tán, cất tinh dầu khối hạt.
* Cách tiến hành:
- Cân chính xác khoảng 20-30 g bột thơ hạt sa nhân cho vào bình cầu dung tích 500 ml, thêm 200 ml nước. Tiến hành cất kéo hơi nước, thời gian cất 4h/ mẫu cất.
- Song song tiến hành đo độ ẩm dược liệu.
- Kết quả định lượng tính hàm lượng tinh dầu của mẫu theo tỷ lệ % thể tích trên khối lượng dược liệu khơ tuyệt đối theo cơng thức:
F .1 0 4 ^ o /0 = ---
* . ( 1 0 0 - ố) Trong đĩ: x% : Hàm lượng tinh dầu.
V: Thể tích tinh dầu cất được (ml), a: Khối lượng dược liệu đem cất (g). b: Độ ẩm của dược liệu (%).
Kết quả xác định hàm lượng tinh dầu các mẫu quả sa nhân được trình bày trong bảng sau:
Bảng 4: Kết quả xác định hàm lượng tinh dầu (HLTD) các mẫu quả sa nhân.
Mẫu Khối lượng dược liệu (a g) Độ ẩm dược liệu ( b %) Thể tích tinh dầu (V ml) HLTD ( X % ) MI 30,62 12,39 1,12 4,18 M2 28,88 11,39 0,96 3,75 M3 18,52 12,22 0,66 4,06 M4 14,59 11,77 0,40 3,11 M5 30,28 12,61 0,84 3,17
♦ Nhận xét: Các số liệu trong bảng trên cho thấy hàm lượng tinh dầu hạt các mẫu quả sa nhân khá cao ( 3,11%- 4,18%), khẳng định đây là các mẫu
sa nhân cần quan tâm.
3.2.3. Phân tích thành phần hố học tinh dầu hạt các mẫu quả sa nhân:
Chúng tơi đã sử dụng phương pháp GC - MS phân tích thành phần hố học tinh dầu hạt các mẫu quả sa nhân. Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng sau.
Bảng 5: Kết quả phân tích thành phần hố học tinh dầu hạt các mẫu quả sa nhân. STT Rt T h àn h phần M I (% ) M2 (% ) M3 (% ) M4 (% ) M5 (% ) 1 7,03 a - pinen 0,20 0,11 0,15 Vết 0,11 2 8,20 Camphen 2,10 1,67 2,00 0,81 2,01 3 9,92 Myrcen 1,10 1,00 1,42 0,70 1,13 4 10,60 a - phellandren 0,05 Vết 0,06 Vết Vết 5 11,86 L- lim onen 3,40 3,15 4,22 2,30 3,38 6 11,97 Dihydrocarveol 0,20 0,18 0,14 0,08 Vết 7 12,01 Cineol Vết Vết Vết Vết 0,15 8 15,67 Linalol 0,30 0,40 0,21 0,20 0,23 9 15,95 Nerol 0,10 0,13 0,06 0,07 0,08 10 17,78 Camphor 20,90 24,82 30,04 34,39 35,80 11 18,53 Iso- bomeol 0,60 0,98 0,29 0,21 0,50 12 19,07 Bomeol 3,87 5,51 0,75 0,87 1,00 13 20,14 a - terpineol 0,05 Vết Vết 0,05 Vết
14 21,25 Isobomyl acetat 0,03 0,03 Vết Vết Vết 15 23,84 Bornyl acetat 64,31 58,41 56,72 55,52 52,36 16 27,26 Geranyl acetat 0,30 0,15 Vết 0,15 0,10 17 28,73 P- caryophyllen 0,10 0,09 0,12 0,09 0,08 18 30,09 a - humulen 0,77 0,60 1,00 1,00 0,90 19 31,08 D- germacren Vết 0,04 0,18 0,04 Vết 20 33,74 Cis- nerolidol 1,40 2,69 0,90 2,27 1,74 21 37,27 Juniperol 0,20 0,25 0,70 0,59 0,18
Nhận xét: Qua nhận xét bằng cảm quan, chúng tơi thấy các mẫu quả sa nhân trên đều giống nhau: Quả hình cầu, màu tím hồng, cĩ gai nhỏ phủ bên ngồi, kích thước tương đối đồng đều ( Phụ lục 1). Từ kết quả nghiên cứu về hố học, chúng tơi thấy thành phần chính trong tinh dầu các mẫu quả sa nhân:
M l, M2, M3, M4, M5 đều là camphor và bornyl acetat trong đĩ tỷ lệ bornyl acetat cao hơn camphor.
Như vậy, cĩ thể kết luận các mẫu quả sa nhân trên là quả lồi Amomum ovoideum Pierre ( SM1).
> Phân tích thành phần hố học tinh dầu hạt sa nhân Amomum ovoìdeum Pierre, bằng phương pháp GC- MS, chúng tơi đã xác định được 21 thành phần.
> Thành phần chính trong tinh dầu hạt sa nhân là bornyl acetat và
camphor. Hai thành phần này chiếm tỷ lệ hơn 80%. Đây là một tỷ lệ khá cao.