2: mẫu TH3.2.59(chiết bằng phương pháp 2) 3: mẫu JCM8274; 4: mẫu Litchl7
5,6: mẫu TVN309(chiết bằng phương pháp 1 và 2)
3.4. Tinh sạch CoQ
Các mẫu tách chiết được đem sắc ký bản mỏng để tinh sạch CoQ. Các mẫu sau khi tinh sạch có màu đậm nhạt khác nhau :
Các chủng JCM8274, TH3.2.59, Litchl2, Litchl7, CM2320 có màu vàng đậm
Các chủng G376,HB1.3.13,CNTP-7028 có màu nhạt, trong. Các chủng TVN309, Litchl3 hầu như không có màu.
Mẫu sau khi tinh sạch của các chủng JCM8274, TH3.2.59, Litch08, Litchl7, chiết bằng phương pháp 2 hầu như đều không có màu.
Rất có thể là ở phương pháp 2 đã không chiết được CoQ. Chúng ta sẽ có được kết luận rõ ràng ở phần sau.
Để đảm bảo kết quả cho các phần sau, dụng cụ sử dụng trọng thí nghiệm từ giai đoạn này phải thật sạch. Các mẫu dịch chiết sau tinh sạch được bảo quản trong ống eppendorí mới sạch.
Hình 3.6: sắc ký đồ các mẫu Litch08 và JCM8274
3.5. Kết quả xác định chủng loại CoQ
Chúng tôi xác định chủng loại CoQ bằng phương pháp sắc ký bản mỏng. Kỹ thuật mà chúng tôi sử dụng là kỹ thuật sắc ký vói pha đảo ngược (pha tĩnh thân dầu, pha động thân nước). Bản mỏng sau khi được tẩm parafin sẽ có ái lực khác nhau với các CoQ khác nhau: CoQ nào có đuôi hydratcacbon càng dài, càng thân dầu hơn sẽ bị hấp phụ mạnh hơn vào pha tĩnh do đó sẽ di chuyển chậm hơn trong quá trình
chạy sắc ký và ngược lại.Trên cơ sở này, dự đoán CoQlO sẽ nằm ở vị trí thấp nhất, trên nó là CoQ9, tiếp theo là C0Q8, CoQ7, C0Q6 sẽ ở vị trí cao nhất trên sắc ký đồ.
Do không có được CoQ chuẩn, chúng tôi tự tạo chất chuẩn cũng dựa trên cơ sở trên. Trộn các mẫu đã biết loại CoQ: JCM8274(CoQ10), JCM2320(CoQ9),
G376(CoQ8), HB1.3.13(CoQ7), CNTP-7082(CoQ6) với nhau tạo thành hỗn hợp
CoQ, xem là mẫu chuẩn, chấm mẫu chuẩn lên bản mỏng chạy sắc ký, sau khi chạy dung môi sẽ đẩy các CoQ tách ra ở các vi trí khác nhau trên sắc ký đồ tuỳ thuộc vào
ái lực của từng CoQ với pha tĩnh và pha động. Trên cơ sở này đối chiếu vị trí các mẫu để xác định loại CoQ.(Hình 8)
Hình 3.7 : sắc ký đồ kiểm tra mẫu chuẩn tự tạo.
Kết quả chạy sắc ký các mẫu tách chiết được thể hiện ở hình 9 (chúng tôi chỉ tiến hành chạy sắc ký đối vói các mẫu chiết bằng phương pháp 1):
Hình 3.8 ỉ Sắc ký đồ của các mẫu tách chiết
1. TH3259; 2. Litch 12; 3. Litch 17; 4. Litch 08; 5. JCM8274. Q6. CNTP7028; Q7. HB1.3.13; Q8. G376; Q9. JCM2320 Q6. CNTP7028; Q7. HB1.3.13; Q8. G376; Q9. JCM2320
s : mẫu chuẩn.
Căn cứ vào kết quả thu được trên sắc ký đồ và trên cơ sở phân tích trên, chúng tôi có kết luận sau:
CoQlO có trong mẫu dịch chiết của các chủng JCM8274, TH3.2.59, Litch08, Litchl2, Litchl7.
CoQ9 có trong mẫu dịch chiết của chủng JCM2320. C0Q8 có trong mẫu dịch chiết của chủng G376. CoQ7 có trong mẫu dịch chiết của chủng HB1.3.13. C0Q6 có trong mẫu dịch chiết của chủng CNTP-7028.
Riêng với hai chủng TVN309 và Litchl3, mẫu tách chiết sau khi tinh sạch hầu như không có màu. Sau khi chạy sắc ký vị trí chấm mẫu hai chủng này không thấy xuất hiên vệt trên sắc ký đồ. Như vậy, chúng tôi đã không tách chiết được CoQ từ hai chủng nấm men này. Lý do có thể CoQ bị mất đi trong quá trình tách chiết hoặc lượng CoQ trong các chủng này quá ít.
Các vết mẫu trên sắc ký đồ tròn, gọn, có độ đâm nhạt khác nhau(các mẫu được chấm lên bản mỏng với một lượng như nhau 5 |il), điều này thể hiện các mẫu tách chiết tương đối sạch, độ đậm nhạt của vết cho thấy hàm lượng CoQ trong các mẫu có khác nhau.
Trong quá trình chạy sắc ký chúng tôi nhận thấy rằng để có được kết quả sắc ký đồ đẹp và chính xác thì các bươc tiến hành phải rất chuẩn xác. Đặc biệt, dung môi chạy sắc ký phải đảm bảo bão hoà parafin, dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm phải sạch.
3.6. Sơ bộ đánh giá hàm lượng CoQlO của các mẫu tách chiết
Để đánh giá hàm lượng CoQlO trong các mẫu dịch chiết, chúng tôi dùng phương pháp đo quang. Đây là phương pháp thường được dùng để định lượng CoQlO trong các chuyên luận Dược Điển Anh, Mỹ, Nhật Bản. Vì không có chất chuẩn là CoQlO tinh khiết nên ở đây chúng tôi chỉ đánh giá sơ bộ hàm lượng CoQlO trong mẫu tách chiết.
* Kết quả đánh giá mẫu đối chứng : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để tạo mẫu đối chứng làm cơ sở đánh giá: chúng tôi dùng viên nang mềm CoenzymQ10 của hãng ECKHART Corp. (Mỹ), tách chiết, tinh sạch, thu lấy
CoQlO. Chúng tôi tiến hành quét phổ hấp thụ trong bước sóng X = 190 -1100 nm. Kết quả cho thấy mẫu dịch chiết của thuốc hấp thụ trong khoảng bước sóng từ 270nm đến 290 nm. Đỉnh hấp thụ là 274 và không xuất hiện pic lạ. Kết quả này phù hợp với phổ hấp thụ lý thuyết của CoQlO (k = 275 nm) và cho thấy mẫu tách chiết có độ tinh sạch cao (hình 8).
* Kết quả quét phổ hấp thụ các mẫu tách chiết ở Ằ — 190-1100 nm
Kết quả quét phổ hấp thụ 5 mẫu dịch chiết của các chủng JCM8274(hình 9), TH3.2.59, Litchl7, Litchl2, Litch08, trong dải bước sóng từ 190-1 lOOnm được thể hiện ở (phụ lục3-7). Kết quả cho thấy :
Các mẫu đo đều có phổ hấp thụ trong khoảng bước sóng hấp thụ của CoQlO (270-290nm).
Các mẫu đo đều có giá trị X max dao động xung quanh giá trị A, max = 275 của CoQlO theo lý thuyết.
Bảng 3.2 : Kết quả đo độ hấp thụ dịch chiết CoQlO tại Ả max
Mẫu đo của chủng(ký hiệu) Ả max(nm)
JCM8274 274
TH3.2.59 272
Litch08 277
Litchl2 278
Litchl7 274
Các mẫu đo đều không xuất hiện pic lạ.
Giá trị X max dao động trong khoảng từ 272-278 nm là có thể chấp nhận được đối với phép đo phổ hấp thụ tử ngoại. Vì trong phép đo quang phổ tử ngoại, độ nhọn của pic không sắc nên dễ ảnh hưởng đến kết quả Ằ max. Hơn nữa dịch chiết của chúng tôi mới được tinh sạch một lần nên các tạp chất có thể gây ra tương tác sai lệch trong vùng ánh sáng này.
Từ kết quả quét phổ có thể sơ bộ kết luận là các mẫu dịch chiết của 5 chủng JCM8274, TH3.2.59, Litch08, Litchl2, Litchl7 đều chứa CoQlO, độ tinh sạch chấp
sqv
sq
v