Khi bổ sung PMSF vào hỗn hợp phản ứng cho thấy PMSF làm giảm hoạt động của protease. Protease bị ức chế hoàn toàn khi có sự hiện diện của 2 mM PMSF trong hỗn hợp phản ứng (Hình 10). Điều này cho thấy protease tinh sạch được có thể thuộc nhóm serine protease. PMSF tấn công vào vị trí của serine trong tâm hoạt động từ đó làm protease mất đi khả năng xúc tác phản ứng phân hủy protein. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Gupta và cộng sự (2002) cho rằng hầu hết các protease kiềm tính là những serine protease hoặc metallo-protease.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Kết tủa phân đoạn ammonium sulphate kết hợp với sắc ký trao đổi ion trên cột Unosphere Q cho phép tinh sạch một protease kiềm tính có khối lượng phân tử trong khoảng 19,2 kDa từ dịch nuôi cấy Bacillus sp. SV1. Protease này hoạt động tối ưu ở pH 9,0, nhiệt độ 45oC, với sự hiện diện của ion Ca2+ (2,5 mM). Đây có thể là một serine protease, do ở nồng độ PMSF 2,0 mM hoạt tính enzyme bị ức chế hoàn toàn.
5.2. Đề nghị
+ Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Bacillus sp.SV1 để tăng hiệu suất sinh tổng hợp protease.
+ Tối ưu hóa quy trình tinh sạch protease từ dòng vi khuẩn này. + Khảo sát độ bền pH và độ bền nhiệt của protease này.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Dương Thị Hương Giang. 2010. Bài giảng hóa protein. Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ.
Đặng Thị Đăng Phương. 2005. Nghiên cứu thu nhận protease kiềm tính và xử dụng trong xử lý phế liệu da giày. Luận văn thạc sĩ. Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh, trường đại học Khoa học tự nhiên.
Tiếng Anh
Aunstrup, K., H. Ottrup, O. Andresen and C. Dambmann. 1972. Proteases from
alkalophilic Bacillus species. In Proceedings of the 4th international
fermentation symposium. Society of Fermentation Technology, Kyoto, pp. 299-
305.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Gel filtration-Principle and Methods. Code No.18-1022-18.
Barett, A.J. 1995. Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidases. Meth.
Enzymol., 248:183.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal.
Biochem., 72:248-254.
Cowan, D.A. 1994. Industrial Enzymes. In Biotechnology-The science and the
business, ed. V. Moses and R.E. Cape, Switzerland: Harwood Academic
Publishers, pp. 326-328.
Cheng, S.W., H.M. Hu, S.W. Shen, H. Takagi, M. Asano and Y.C. Tsai. 1995. Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis PWD-1. Biosci. Biotechnol. Biochem., 59:2239–2243.
Dalev, P.G. 1994. Utilisation of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate. Bioresource. Technol., 48:265–67.
Dhar, S.C. and S. Sreenivasulu. 1984. Studies on the use of dehairing enzyme for its suitability in the preparation of improved animal feed. Leather Sci., 31:261–67.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Fitzgerald, P.M.D., B.M. McKeever, J.F. Van Middlesworth, J.P. Springer, J.C. Heimbach, Chih-Tai Leu, W.K. Herber, R.A.F. Dixon and P.L. Darke. 1990. Crystallographic analysis of a complex between human immunodeficiency virus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
type 1 protease and acetyl-pepstatin at 2.0A resolution. Biol. Chem., 265:14209–
14219.
Fogarty, W.M., P.J. Griffin and A.M. Joyce. 1974. Enzymes of Bacillus species—Part 2. Process. Biochem., 9:27–29, 31, 33, 35.
Freeman, S.A., K. Peek, M. Prescott, R. Daniel. 1993. Characterization of a chelator- resistant proteinase from Thermus strain Rt4A2. Biochem J., 295:463–69.
Fujiwara, N., A. Masui, T. Imanaka. 1993. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp.
Biotechnol., 30:245–56.
Fujiwara, N. and K. Yamamoto. 1987. Decomposition of gelatin layers on X-ray film by the alkaline protease from Bacillus sp. B21. Ferment. Technol., 65:531–534. Fujiwara, N., K. Yamamoto, and A. Masui. 1991. Utilization of thermostable alkaline
protease from an alkalophilic thermophile for the recovery of silver from used X- ray film. Ferment. Bioeng., 72:306–308.
Genckal, H. 2004. Study on alkaline protease production from Bacillus sp. (Unpublish master’s thesis). İzmir Institute of Technology, Izmir, Turkey.
George, S., B. Sivasankar, K. Jayaraman and M.A. Vijayalakshmi. 1997. Production and separation of the methioninerich fraction from chick pea protein hydrolysate generated by proteases of Bacillus amyloliquefaciens. Proc. Biochem., 32:401–4. Gupta, R., Q.K. Beg., S. Khan and B. Chauhan. 2002. An overview on fermentation,
downstream processing and properties of microbial alkaline proteases. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 60: 381.
Hames, P.D. 1998. One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In Gel
electrophoresis of proteins: A practical approach, Oxford: Oxford University
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Han, X.Q. and S. Damodaran. 1998. Purification and characterization of protease Q: A detergent- and ureastable serine endopeptidase from Bacillus pumilus. Agr. Food.
Chem., 46:3596–3603.
Hartley, B. S. 1960. Proteolytic enzymes. Annu. Rev. Biochem., 29:45–72.
Hibbs, M. S., K.A. Hasty, J.M. Seyer, A.H. Kang, and C.L. Mainardi. 1985. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinase. Biol. Chem., 260:2493–2500.
Horikoshi, K. and T. Akiba. 1982. Alkalophilic Microorganisms: A New Microbial World. Tokyo, Japan: Japan Scientific Societies Press and Berlin, Germany: Springer-Verlag, pp.55.
Horikoshi, K. 1971. Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms.
Part I. Alkaline protease produced by Bacillus No. 221. Agr. Biol .Chem.,
35:1407–414.
Horikoshi, K. 1971. Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms. Part II. Alkaline amylase produced by Bacillus No. A-40-2. Agr. Biol. Chem.,
35:1783–1791.
Horikoshi, K. 1999. Alkaliphiles: Some applications of their products for biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63(4): 735.
Horikoshi, K. 2011. Extremophiles handbook. In Extremophiles: Alkiliphiles. Berlin, Germany: Springer, pp. 95
International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 1992. Enzyme nomenclature. Orlando, Fla: Academic Press, Inc.
Joo, H., G. Kumar, G., Park, K. T., Kim, S. R., Paik and C., Chang.2002. Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshii. Proc. Biochem., 38:155.
Joo, H., and J., W., Choi. 2012. Purification and characterization of a novel alkaline protease from Bacillus horikoshii. Biol. Chem., 64: 234-235. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kim, S.S, Y.J. Kim and I. Rhee. 2001. Purification and characterization of a novel
extracellular protease from Bacillus cereus KCTC 3674. Arch. Microbiol.,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Kobayashi, T., Y. Hakamada, S. Adachi, J. Hitomi , T. Yoshimatsu, K. Koike, S. Kawai and S. Ito. 1995. Purification and properties of an alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. KSM-K16. Appl. Microbiol. Biotechnol., 43:473–81. Kobayashi, T., Y. Hakamada, J. Hitomi, K. Koike and S. Ito. 1996. Purification of
alkaline proteases from a Bacillus strain and their possible interrelationship. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 45:63–71.
Kudrya, V.A. and I.A Simonenko. 1994. Alkaline serine proteinase and lectin isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis. Applied. Microbiol. Biotechnol.,
41:505.
Kumar, C.G. and H. Takagi. 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. Biotechnol. Adv., 17:561.
Kumar, C.G. 1997. Studies on microbial alkaline proteases for use in dairy detergents. Ph.D. thesis. National Dairy Research Institute (Deemed University), Karnal, India.
Kunitz, M. 1947. Crystalline soyabean trypsin inhibitor. II. Genaral properties. Gen. Physiol., 30: 291-310.
Kwon, Y.T., J.O. Kim, S.Y. Moon, H.H. Lee and H.M Rho. 1994. Extracellular
alkaline protease from alkalophilic Vibrio metschnikovii strain RH530.
Biotechnol. Lett. 16:413-18.
Khan, M.A., N. Ahmad, U.A. Zafar, I.A. Nasir, and M.A. Qadir. 2011. Isolation and screening of alkaline protease producing bacteria and physio-chemical characterization of the enzyme. Afr. J. Biotech., 10(33): 6203-6212.
Labbe, J. P., P. Rebegrotte, and M. Turpine. 1974. Demonstrating extra-cellular
leucine aminopeptidase (EC 3.4.1.1) of Aspergillus oryzae (IP 410): leucine
aminopeptidase 2 fraction. C. R. Acad. Sci., 278:2699.
Larcher, G., B. Cimon, F. Symoens, G. Tronchin, D. Chabasse and J.P. Bouchara.
1996. A 33 kDa serine proteinase from Scedosporium apiospermum. Biochem.,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Manachini, P. L, and M. G. Fortina. 1998. Production in sea-water of thermostable alkaline proteases by a halotolerant strain of Bacillus licheniformis. Biotechnol. Letters, 20: 565.
Menon, A. S., and A. L. Goldberg. 1987. Protein substrates activate the ATP- dependent protease La by promoting nucleotide binding and release of bound ADP. Biol. Chem., 262:14929-14934.
Mukhopadhyay, R.P., and A.L. Chandra. 1992. Application of a Streptomycete in the removal of waste keratinous materials. Ed. V.S. Malik and P. Sridhar . Industrial Biotechnology. New Delhi: Oxford & IBH Publishing Co. Pvt. Ltd. pp. 595–97. Nakanishi, T., Y. Matsumura, N. Minamiura and T. Yamamoto. 1974. Purification and
some properties of an alkalophilic proteinase of a Streptomyces species. Agric. Biol. Chem., 38:37–44.
Rao, M. B., A. M. Tanksale, S. G. Mohini, V. V. Deshpande. 1998. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62: 597.
Rawlings, N.D., D.P. Tolle and A.J. Barrett. 2004. Evolutionary families of peptidase inhibitors. Biochem., 378:705-716.
Richard, R.B. and M. P. Deutscher. 2010. Guide to Protein Purification. Method in enzymology, 463: 335, 349-370, 373-385.
Samal, B.B., B. Karan, C. Parker and Y. Stabinsky. 1991. Isolation and thermal stability of two novel serine proteinases from the fungus Tritirachium album
Limber. Enzyme. Microb. Technol., 13:66-70. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Shannon, J.D., E.N. Baramova, J.B. Bjarnason and J.W. Fox. 1989. Amino acid
sequence of a Crotalus atrox venom metalloprotease which cleaves type IV
collagen and gelatin. Biol. Chem., 264:11575-11583.
Shih, J.C.H and C.G. Lee. 1993. Method and composition for maintaining animals on a keratin-containing diet. US Patent No., 5186971.
Singh, J., N. Batra, R. C. Sobti. 2001. Serine alkaline protease from a newly isolated
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Shirai, T., A. Suzuki, T. Yamane, T. Ashida, T. Kobayashi, J. Hitomi, S. Ito . 1997. High-resolution crystal structure of M-protease: phylogeny aided analysis of the high-alkaline adaptation mechanism. Protein. Eng., 10:627-634.
Shoemaker, S. 1986. Biotechnology in Food Processing. 1986. In The use of enzymes
for waste management in the food industry. Ed. S.K. Harlander and T.P. Labuza,
Park Ridge, NJ: Noyes Publications, pp. 259-67.
Sloma, A., A. Ally, D. Ally, and J. Pero. 1988. Gene encoding a minor extracellular protease in Bacillus subtilis. Bacteriol., 170:5557–5563.
Steele, D.B., M.J. Fiske, B.P. Steele and V.C. Kelley. 1992. Production of a low molecular weight, alkaline active, thermostable protease by a novel spiral-shaped bacterium, Kurthia spiroforme sp. nov. Enzyme. Microb. Technol., 14:358-60. Takagi, H., M. Kondou, T. Hisatsuka, S. Nakamori, Y.C. Tsai and M. Yamasaki.
1992. Effects of an alkaline elastase from an alkalophilic Bacillus strain on the
tenderization of beef meat. Agric. Food. Chem., 40:2364-68.
Takami, H., T. Akiba, K. Horikoshi .1992. Substrate Specificity of Thermostable
Alkaline Protease from Bacillus sp. No.AH-101. Biosci. Biotechnol. Biochem.,
56:333-334.
Takami, H., T. Akiba and K. Horikoshi. 1990. Characterization of an alkaline protease from Bacillus sp. no. AH-101. Appl. Microbiol. Biotechnol., 33:519-23.
Tobe, S., T. Takami, Y. Hirose and K. Mitsugi. 1995. Purification and some properties of alkaline proteinases from Bacillus sp. Agric. Biol. Chem., 39:1749-55.
Tsujibo, H., K. Miyamoto, T. Hasegawa and Y. Inamori. 1990. Purification and characterization of two types of alkaline serine proteases produced by an alkalophilic Actinomycete. Appl. Bacteriol., 69:520–29.
Voet, D., J.G. Voet and C.W. Pratt. 2013. Life at molecular Level. In Fundamental of
biochemistry, New York: John Willey and sons, pp. 450-451.
Watson, R. R. 1976. Substrate specificities of aminopeptidases: a specific method for microbial differentiation. Meth. Microbiol., 9:1–14.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Weaver, L.H., W.R. Kester and B.W. Matthews. 1977. A crystallographic study of the complex of phosphoramidon with thermolysin. A model for the presumed catalytic transition state and for the binding of structures. Mol. Biol., 114:119-
132.
Wilhelm, S.M., I.E. Collier, A. Kronberger, A.Z. Eisen, B.L. Marmer, G.A. Grant, E. A. Bauer and G.I. Goldberg. 1987. Human skin fibroblast stromelysin: structure, glycosylation, substrate specificity and differential expression in normal and tumorigenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. , 84:6725-6729.
Wilson, S.A., O.A. Young, T. Coolbear and R.M. Daniel. The use of proteases from extreme thermophiles for meat tenderization. Meat. Sci., 1992;32:93–103.
Yum, D.Y., H.C. Chung , D.H Bai, D.H. Oh and J.H. Yu. 1994. Purification and characterization of alkaline serine protease from an alkalophilic Streptomyces sp.
Biosci. Biotechnol. Biochem., 58:470–74. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Zaghloul, T.I., M. AlBahra and H. AlAzmeh. 1998. Isolation, identification, and
keratinolytic activity of several feather-degrading bacterial isolates. Appl.
Biochem. Biotechnol., 70(2):207–213.
Zuidweg, M.H.J., C.J.K. Bos and H. van Welzen. 1972. Proteolytic components of alkaline proteases of Bacillus strains. Zymograms and electrophoretic isolation. Biotechnol. Bioeng., 14:685–714. Trang web http://skhcn.hue.gov.vn/Portal/?GiaoDien=11&ChucNang=341&NewsID=201203261 51527 : (ngày 07/07/2013) http://www.prweb.com/releases/industrial_enzymes/proteases_carbohydrases/prweb81 21185.htm : (ngày 07/07/2013)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 39 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các phương pháp phân tích
1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
Dung dịch protease được xác định hàm lượng bằng phương pháp Bradford (1976). Tiến hành theo các bước sau:
Chuẩn bị dung dịch Bradford gốc
Hòa tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G250 trong 50 mL ethanol 95%. Sau đó cho thêm 100 mL acid phosphoric 85% khuấy đều. Bổ sung thêm nước cất cho đến 1lít. Sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman no. 1 và trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng. Có thể giữ để sử dụng trong vài tuần nhưng trong thời gian này chất màu có thể bị tủa nên khi sử dụng cần phải lọc lại.
Chuẩn bị dung dịch BSA chuẩn
Cân 3mg BSA, hòa tan trong 1 mL nước cất. Giữ ở -20oC. Thu được dung dịch gốc có nồng độ 3mg/mL.
Dựng đường chuẩn BSA
Pha loãng dung dịch protein chuẩn để có dãy ống nghiệm với hàm lượng protein tăng dần từ 0-300µg/mL theo bảng sau:
Nồng độ BSA (µg/mL) 0 30 60 120 180 240 300 Dung dịch BSA chuẩn (µL) 0 10 20 40 60 80 100 Đệm (µL) 1000 990 980 960 940 920 900 Tổng thể tích (µL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 40 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Phản ứng với thuốc thử Bradford
- Chuẩn bị dãy ống nghiệm, đánh số từ 0-7 (thí nghiệm lặp lại 3 lần 7x3= 21 ống
nghiệm)
- Lấy 100 µL dung dịch protein từ dãy pha loãng trên cho vào các ống theo độ
pha loãng tăng dần.
- Thêm vào 2 mL thuốc thử Bradford.
- Trộn nhẹ các ống bằng máy vortex. Tránh tạo bọt. Ủ trong 20 phút.
- Đo quang phổ ở bước sóng 595nm. Điều chỉnh OD của ống 0 về giá trị 0.
- Ghi nhận lại kết quả.
- Tính giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
- Vẽ biểu đồ đường chuẩn (đường tuyến tính giữa nồng độ protein (mg/mL) với
độ hấp thụ tại bước sóng 595 nm (A595nm)).
Định lượng protein
- 100 µL mẫu được cho phản ứng với thuốc thử Bradford như mô tả ở trên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Mẫu đối chứng: 100 µL nước + thuốc thử Bradford
- Đo độ hấp thụ tại bước sóng 595 nm (A595nm)
Thí nghiệm lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả và tính giá trị trung bình.
Dựa vào biểu đồ đường chuẩn xác định hàm lượng protein trong các mẫu.
Tính toán kết quả: Hàm lượng protein trong mẫu được xác định theo công thức
P = p*V*k trong đó: P: protein tổng trong mẫu (mg)
p: hàm lượng protein mẫu pha loãng (mg/mL) V: thể tích dịch chiếc thô thu được
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 41 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Kết quả dựng đường chuẩn BSA
2. Xác định hoạt tính protease
Dịch protease được kiểm tra hoat tính bằng phương pháp Kunitz cải tiến. Phương pháp đo hoạt tính này dựa vào phản ứng thủy phân cơ chất casein bằng protease để cho ra các acid amin và peptide. Phản ứng được dừng lại bằng acid tricloroacetic. Sau đó, sản phẩm sinh ra đựợc xác định dựa vào độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 280 nm.
Đơn vị đo hoạt tính protease: 1 Đơn vị hoạt protease được biểu hiện qua đơn vị tyrosin TU (Tyrosin Unit), là lượng enzyme cần thiết để thủy phân casein cho ra
1µmol tyrosine (~ 0,181 mg) trong một phút ở 37oC, and pH 9.
Các bước tiến hành
Chuẩn bị hóa chất
- Dung dịch đệm Glycine-NaOH 50mM, pH=9
- Dung dịch TCA nồng độ 15% (w/v)
- Casein 0,6% (w/v) trong dung dịch đệm Glycine-NaOH đã chuẩn bị ở trên.
Casein được hòa tan trong đệm bằng cách đun cách thủy ở 95oC trong khoảng
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 42 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Dựng đường chuẩn Tyrosin
- Chuẩn bị các ống nghiệm theo bảng sau
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6
Tyrosin
(µmol/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Vtyrosin(µl) 0 300 600 900 1200 1500
VHCl 0.1N(µl) 1500 1200 900 600 300 0
- Các dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280nm
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tính giá trị trung bình
- Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ tyrosin (µmol/mL) và độ hấp thụ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kêt quả dựng đường chuẩn Tyrosin
Đo hoạt tính của protease
Thí nghiệm được lặp lại ba lần và tiến hành trong các eppendorf. Tiến hành cho