Số liệu được phân tích thống kê bằng phần mền thống kê Statgraphics centurion phiên bản XV.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tinh sạch protease
4.1.1. Kết tủa bằng ammonium sulfate
Khi thực hiện kết tủa bằng ammonium sulfate ở các nồng độ từ 20-90% bão hòa cho thấy protease kết tủa ở 2 phân đoạn 60% và 80% AS bão hòa với hoạt tính riêng lần lượt là 9,5 U/mg và 5,7 U/mg. Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE và điện di nhuộm hoạt tính với cơ chất casein các phân đoạn cho thấy đã thu nhận được 2 dạng protease có phân tử lượng lần lượt là 30,8 và 19,2 kDa (Hình 4). Trong đó, protease có phân tử lượng 19,2 kDa kết tủa ở phân đoạn 60% AS bão hòa (B1, B2) và protease có phân tử lượng 30,8 kDa kết tủa ở phân đoạn 80% AS bão hòa (B3, B4). Tuy nhiên, ở phân đoạn 80% AS bão hòa vẫn còn lẫn tạp một lượng protease phân tử lượng 19,2 kDa. Điều này có thể do ở nồng độ muối 60% AS bão hòa vẫn còn một lượng nhỏ protease này hiện diện trong dung dịch enzyme thô. Trước đó, Kumar và Takagi (1999) cũng đã công bố hầu hết các protease kiềm tính có phân tử lượng trong khoảng 15-30 kDa, ngoại trừ một vài trường hợp ngoại lệ.
Hình 4. Kết quả điện di trên gel arylamide (A) và điện di nhuộm hoạt tính trên cơ chất casein của các phân đoạn protein (B)
A1. Phân đoạn 80% không xử lý BME; A2. Phân đoạn 80% có xử lý BME; A3. Phân đoạn 60% không xử lý BME; A4. Phân đoạn 60% có xử lý BME. B1. Phân đoạn 60% không xử lý BME; B2. Phân đoạn 60% có xử lý BME; B3. Phân đoạn 80% không xử lý BME; B4. Phân đoạn 80% có xử lý BME.
116kDa 66,2 45 35 25 18,4 14,4 A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4 A B
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Kết quả điện di SDS-PAGE và điện di nhuộm hoạt tính cũng cho thấy cả hai loại protease thu nhận được điều ở dạng đơn phân và không có cầu nối disulfite trong cấu trúc phân tử của chúng. Cả hai thể hiện một band duy nhất trên gel và đều giữ được hoạt tính phân giải casein ngay cả khi được xử lý với BME (Hình 4. B2, B4) (BME là một chất khử có khả năng phá hủy các cấu nối disulfite (nếu có) trong cấu trúc của các enzyme, đồng thời làm mất đi khả năng xúc tác của các enzyme này). Trước đó, Singh và cộng sự (2001) đã công bố tinh sạch được một protease đơn phân tử có khối lượng vào khoảng 28,7kDa từ Bacillus sphaericus.
Do các phân đoạn enzyme sau khi kết tủa còn lẫn nhiều protein tạp (có nhiều band protein) (Hình 4.A), nên cần được nghiên cứu tinh sạch tiếp theo bằng phương pháp sắc ký và phân đoạn 60% AS bão hòa có hoạt tính riêng cao nhất (9,5 U/mg) được chọn cho các bước tinh sạch tiếp theo.
4.1.2. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion (ion exchange chrotomagraphy) chrotomagraphy)
4.1.2.1. Sắc ký trao đổi ion dương
Hình 5. Biểu đồ sắc ký trên cột SP-streamline của phân đoạn protein 60% bão hòa.
Sau khi cho phân đoạn 60% bão hòa đi qua cột sắc ký trao đổi ion dương SP- streamline, hầu như toàn bộ protein của phân đoạn này không bám vào gel sắc ký và tập trung vào phân đoạn không bám với lượng protein tổng thu được ở phân đoạn này
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
là 15,4 mg và hoạt tính riêng là 9,6 U/mg (Hình 5). Điều đó có nghĩa cột sử dụng SP- streamline với đệm phosphate 50 mM pH 7,8 không thể tinh sạch được protease ở phân đoạn 60% AS bão hòa một cách hiệu quả. Do đó, toàn bộ phần phân đoạn protein không bám này được tiếp tục cho đi qua cột sắc ký trao đổi ion âm Unosphere Q với cùng một dung dịch đệm pH 7,8.
4.1.2.2. Sắc ký trao đổi ion âm
Hình 6. Biểu đồ sắc ký trên cột UnosphereQ của phân đoạn protein 60% bão hòa.
Sau khi cho phân đoạn không bám đi qua cột sắc ký trao đổi ion âm Unosphere Q với đệm phoshate 50 mM pH 7,8 thu được 3 phân đoạn protein gồm phân đoạn không bám, phân đoạn F1 và F2 (Hình 7). Trong đó, phân đoạn không bám có hoạt tính riêng là 214,29 U/mg; hai phân đoạn F1 và F2 hoàn toàn không có hoạt tính. Như vậy, protease đều không bám vào gel ở cả hai cột SP-streamline và Unosphere Q ở pH 7,8. Điều này có thể là do protease có giá trị pI rất gần với giá trị của dung dịch đệm phosphate là 7,8. Chính vì vậy, protease chỉ có thể tương tác một cách lõng lẽo với gel (trong cả hai trường hợp) nên dễ dàng đi ra khỏi cột chỉ nhờ vào lực ion rất yếu của dung dịch đệm.
Mặc dù được đẩy ra khỏi cột trong phân đoạn không bám, nhưng kết quả điện di trên gel SDS-PAGE và điện di nhuộm hoạt tính với cơ chất casein cho thấy protease
Không bám
F1
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
đã được tinh sạch thành công bằng việc thể hiện một band duy nhất trên gel (Hình 7. A1).
Hình 7. Kết quả điện di các phân đoạn protein sau khi qua cột sắc ký (A) và kết quả điện di nhuộm hoạt tính trên gel casein (B)
A1: không bám; A2: phân đoạn F2; A3: phân đoạn F1; A4: Dịch enzyme thô B1: không bám không xử lý BME; B2: không bám có xử lý BME.
Theo bảng 2, hiệu suất thu hồi protein sau khi tiến hành sắc khí trao đổi ion âm là 0,8%, tuy nhiên, protease được tinh sạch có hoạt tính riêng khá cao 214,29 U/mg với độ tinh sạch là 50,35 lần. Hoạt tính riêng của protease tinh sạch (214,29 U/mg) cao hơn so với protease được từ Bacillus strain 18' (99,4 U/mg) trong nghiên cứu của Fujiwara và cộng sự (1991). Tuy nhiên thấp hơn so với protease từ Bacillus hirokoshi (1.232,5 U/mg) được công bố bởi Joo và Choi (2012).
A1 A2 A3 A4 B1 B2 116kDa 66,2 45 35 25 18,4 14,4 A B Protease Protease
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bảng 2. Bảng tổng kết các bước tinh sạch protease
Bước tinh sạch Thể tích (mL) Protein (mg/mL) Protein tổng (mg) Hoạt tính (U/mL) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Hiệu suất thu hồi protein(%) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) Độ tinh sạch Dịch enzyme thô 400 0,18 70,40 0,75 299,60 4,26 100 100 1 Tủa phân đoạn 20 0,78 15,60 7,44 148,80 9,54 22,20 49,70 2,24 Sắc ký trao đổi ion dương 20 0,77 15,4 7,41 148,20 9,62 21,90 49,50 2,26 Sắc ký trao đổi ion âm 35 0,02 0,60 3,64 127,51 214,29 0,80 42,60 50,35
4.2. Khảo sát một số yếu tố pH, nhiệt độ, ion Ca2+ và chất ức chế PMSF đến hoạt động của protease hoạt động của protease
4.2.1. Ảnh hưởng của pH
Hình 8. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của protease
Kết quả khảo sát hoạt động của protease ở các điều kiện pH khác nhau từ 6-12 (6, 7, 8, 9, 10, 11, 12) cho thấy protease có thể hoạt động tốt trong khoảng pH từ 8-10
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
và hoạt động tối ưu ở pH 9 với hoạt tính là 3,610 U/mL (Hình 8); hầu như mất hoàn toàn hoạt tính ở pH ≥12. pH tối ưu của protease được tinh sạch tương đối thấp hơn so với một số protease đặc biệt có pH tối ưu rất cao vào khoảng 11,5 (Yum et al., 1994; Tobe et al., 1995; Takami, 1990), pH 11-12 (Horikoshi, 1971; Kumar, 1997), pH 12,3 (Nakanishi et al., 1974; Kobayashi et al.; 1995 201 ) và pH 12-13 (Fujiwara et al., 1993). Tuy nhiên, kết quả này lại phù hợp với nghiên cứu của Kumar và Takagi (1999) trong đó các protease chịu kiềm từ vi khuẩn thông thường có pH tối ưu trong khoảng 9 đến 11. Trong các nghiên cứu của Joo và cộng sự (2002) và Manachini và Fortina (1998) trên protease từ Bacillus horikoshi và Bacillus licheniformis trên cơ chất casein đều cho thấy chúng hoạt động tối ưu ở pH 9.
4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của protease
Hình 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của protease
Sau khi khảo sát hoạt động của protease ở điều kiện nhiệt độ khác nhau (30, 35,
40, 45, 50, 55, 60 và 65 oC) cho thấy protease có thể hoạt động trong khoảng nhiệt độ
từ 35-50 oC, hoạt động tối ưu trong khoảng 45 oC và mất hoạt tính khi ủ ở nhiệt độ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Bacillus horikoshi (45 oC) (Joo et al., 2002) nhưng thấp hơn so với protease từ
Bacillus licheniformis (70oC) (Manachini & Fortina., 1998).
4.2.3. Ảnh hưởng của ion Ca2+ lên hoạt động của protease
Sự hiện diện của 2,5 mM ion Ca2+ trong hỗn hợp phản ứng giúp nâng cao hoạt
tính của protease gấp hai lần từ 3,61 U/mL lên đến 7,185 U/mL. Khi gia tăng nồng độ
ion Ca2+ lên 5mM và 10 mM không cho thấy sự nâng cao về hoạt tính cũng như ức chế
đối với protease (Bảng 3). Một nghiên cứu của Horikoshi (1999) cũng cho thấy protease từ chủng Bacillus 221 tăng 70% hoạt tính khi bổ sung 5 mM Ca2+ vào hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ tối ưu là 60oC.
Bảng 3. Ảnh hưởng của ion Ca2+ đến hoạt động của protease Nồng độ Ca2+ Hoạt tính (U/mL) 0 3,61b 2,5 7,18a 5 7,16a 10 7,17a
4.2.4. Ảnh hưởng của PMSF lên hoạt động của protease
Khi bổ sung PMSF vào hỗn hợp phản ứng cho thấy PMSF làm giảm hoạt động của protease. Protease bị ức chế hoàn toàn khi có sự hiện diện của 2 mM PMSF trong hỗn hợp phản ứng (Hình 10). Điều này cho thấy protease tinh sạch được có thể thuộc nhóm serine protease. PMSF tấn công vào vị trí của serine trong tâm hoạt động từ đó làm protease mất đi khả năng xúc tác phản ứng phân hủy protein. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Gupta và cộng sự (2002) cho rằng hầu hết các protease kiềm tính là những serine protease hoặc metallo-protease.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Kết tủa phân đoạn ammonium sulphate kết hợp với sắc ký trao đổi ion trên cột Unosphere Q cho phép tinh sạch một protease kiềm tính có khối lượng phân tử trong khoảng 19,2 kDa từ dịch nuôi cấy Bacillus sp. SV1. Protease này hoạt động tối ưu ở pH 9,0, nhiệt độ 45oC, với sự hiện diện của ion Ca2+ (2,5 mM). Đây có thể là một serine protease, do ở nồng độ PMSF 2,0 mM hoạt tính enzyme bị ức chế hoàn toàn.
5.2. Đề nghị
+ Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Bacillus sp.SV1 để tăng hiệu suất sinh tổng hợp protease.
+ Tối ưu hóa quy trình tinh sạch protease từ dòng vi khuẩn này. + Khảo sát độ bền pH và độ bền nhiệt của protease này.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
Dương Thị Hương Giang. 2010. Bài giảng hóa protein. Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Đại học Cần Thơ.
Đặng Thị Đăng Phương. 2005. Nghiên cứu thu nhận protease kiềm tính và xử dụng trong xử lý phế liệu da giày. Luận văn thạc sĩ. Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh, trường đại học Khoa học tự nhiên.
Tiếng Anh
Aunstrup, K., H. Ottrup, O. Andresen and C. Dambmann. 1972. Proteases from
alkalophilic Bacillus species. In Proceedings of the 4th international
fermentation symposium. Society of Fermentation Technology, Kyoto, pp. 299-
305.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Gel filtration-Principle and Methods. Code No.18-1022-18.
Barett, A.J. 1995. Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidases. Meth.
Enzymol., 248:183.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal.
Biochem., 72:248-254.
Cowan, D.A. 1994. Industrial Enzymes. In Biotechnology-The science and the
business, ed. V. Moses and R.E. Cape, Switzerland: Harwood Academic
Publishers, pp. 326-328.
Cheng, S.W., H.M. Hu, S.W. Shen, H. Takagi, M. Asano and Y.C. Tsai. 1995. Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis PWD-1. Biosci. Biotechnol. Biochem., 59:2239–2243.
Dalev, P.G. 1994. Utilisation of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate. Bioresource. Technol., 48:265–67.
Dhar, S.C. and S. Sreenivasulu. 1984. Studies on the use of dehairing enzyme for its suitability in the preparation of improved animal feed. Leather Sci., 31:261–67.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Fitzgerald, P.M.D., B.M. McKeever, J.F. Van Middlesworth, J.P. Springer, J.C. Heimbach, Chih-Tai Leu, W.K. Herber, R.A.F. Dixon and P.L. Darke. 1990. Crystallographic analysis of a complex between human immunodeficiency virus
type 1 protease and acetyl-pepstatin at 2.0A resolution. Biol. Chem., 265:14209–
14219.
Fogarty, W.M., P.J. Griffin and A.M. Joyce. 1974. Enzymes of Bacillus species—Part 2. Process. Biochem., 9:27–29, 31, 33, 35.
Freeman, S.A., K. Peek, M. Prescott, R. Daniel. 1993. Characterization of a chelator- resistant proteinase from Thermus strain Rt4A2. Biochem J., 295:463–69.
Fujiwara, N., A. Masui, T. Imanaka. 1993. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp.
Biotechnol., 30:245–56.
Fujiwara, N. and K. Yamamoto. 1987. Decomposition of gelatin layers on X-ray film by the alkaline protease from Bacillus sp. B21. Ferment. Technol., 65:531–534. Fujiwara, N., K. Yamamoto, and A. Masui. 1991. Utilization of thermostable alkaline
protease from an alkalophilic thermophile for the recovery of silver from used X- ray film. Ferment. Bioeng., 72:306–308.
Genckal, H. 2004. Study on alkaline protease production from Bacillus sp. (Unpublish master’s thesis). İzmir Institute of Technology, Izmir, Turkey.
George, S., B. Sivasankar, K. Jayaraman and M.A. Vijayalakshmi. 1997. Production and separation of the methioninerich fraction from chick pea protein hydrolysate generated by proteases of Bacillus amyloliquefaciens. Proc. Biochem., 32:401–4. Gupta, R., Q.K. Beg., S. Khan and B. Chauhan. 2002. An overview on fermentation,
downstream processing and properties of microbial alkaline proteases. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 60: 381.
Hames, P.D. 1998. One-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. In Gel
electrophoresis of proteins: A practical approach, Oxford: Oxford University
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Han, X.Q. and S. Damodaran. 1998. Purification and characterization of protease Q: A detergent- and ureastable serine endopeptidase from Bacillus pumilus. Agr. Food.
Chem., 46:3596–3603.
Hartley, B. S. 1960. Proteolytic enzymes. Annu. Rev. Biochem., 29:45–72.
Hibbs, M. S., K.A. Hasty, J.M. Seyer, A.H. Kang, and C.L. Mainardi. 1985. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinase. Biol. Chem., 260:2493–2500.
Horikoshi, K. and T. Akiba. 1982. Alkalophilic Microorganisms: A New Microbial World. Tokyo, Japan: Japan Scientific Societies Press and Berlin, Germany: Springer-Verlag, pp.55.
Horikoshi, K. 1971. Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms.
Part I. Alkaline protease produced by Bacillus No. 221. Agr. Biol .Chem.,
35:1407–414.
Horikoshi, K. 1971. Production of alkaline enzymes by alkalophilic microorganisms. Part II. Alkaline amylase produced by Bacillus No. A-40-2. Agr. Biol. Chem.,
35:1783–1791.
Horikoshi, K. 1999. Alkaliphiles: Some applications of their products for biotechnology. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 63(4): 735.
Horikoshi, K. 2011. Extremophiles handbook. In Extremophiles: Alkiliphiles. Berlin, Germany: Springer, pp. 95
International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 1992. Enzyme nomenclature. Orlando, Fla: Academic Press, Inc.
Joo, H., G. Kumar, G., Park, K. T., Kim, S. R., Paik and C., Chang.2002. Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshii. Proc. Biochem., 38:155.
Joo, H., and J., W., Choi. 2012. Purification and characterization of a novel alkaline protease from Bacillus horikoshii. Biol. Chem., 64: 234-235.
Kim, S.S, Y.J. Kim and I. Rhee. 2001. Purification and characterization of a novel
extracellular protease from Bacillus cereus KCTC 3674. Arch. Microbiol.,
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Kobayashi, T., Y. Hakamada, S. Adachi, J. Hitomi , T. Yoshimatsu, K. Koike, S. Kawai and S. Ito. 1995. Purification and properties of an alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. KSM-K16. Appl. Microbiol. Biotechnol., 43:473–81. Kobayashi, T., Y. Hakamada, J. Hitomi, K. Koike and S. Ito. 1996. Purification of
alkaline proteases from a Bacillus strain and their possible interrelationship. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 45:63–71.
Kudrya, V.A. and I.A Simonenko. 1994. Alkaline serine proteinase and lectin isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis. Applied. Microbiol. Biotechnol.,
41:505.
Kumar, C.G. and H. Takagi. 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial viewpoint. Biotechnol. Adv., 17:561.
Kumar, C.G. 1997. Studies on microbial alkaline proteases for use in dairy detergents. Ph.D. thesis. National Dairy Research Institute (Deemed University), Karnal, India.
Kunitz, M. 1947. Crystalline soyabean trypsin inhibitor. II. Genaral properties. Gen. Physiol., 30: 291-310.
Kwon, Y.T., J.O. Kim, S.Y. Moon, H.H. Lee and H.M Rho. 1994. Extracellular
alkaline protease from alkalophilic Vibrio metschnikovii strain RH530.