2.1- Định lượng enzym
Có thể được thực hiện dựa theo tác động xúc tác của chúng tương ứng với việc chuyển đỗi một cơ chất thành một sản phẩm.
Để định lượng enzym cần phải:
- biết phương trình cân bằng của phản ứng được xúc tác
- thiết lập qui trình phân tích cho phép định lượng hoặc là sự mất đi của cơ chất, hoặc là sự xuất hiện của sản phẩm.
- chú ý vai trò của các chất đồng phối hợp (cofactor), pH, và nhiệt độ. Ơ ûloài hữu nhũ, các enzym thường họat động trong khoảng nhiệt độ từ 25 – 37 độ C
- Vận tốc của phản ứng cũng ảnh hưởng đến việc đo lường hoạt độ của enzym (cung cấp đầy đủ cơ chất để vận tốc phản ứng ban đầu tỷ lệ với nồng độ enzym)
2- CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT ĐỘ CỦA ENZYM
Nếu cơ chất (hay sản phẩm) hấp thu ánh sáng ở một bước sóng nhất định, sự biến thiên của nồng độ của những chất này có thể được đo bằng cách khảo sát sự biến thiên của độ hấp thu ở bước sóng đó.
Mật độ quang học tỷ lệ với nồng độ; tốc độ biến thiên của độ hấp thu tỷ lệ với tốc độ phản ứng enzym được biểu thị bằng số mol cơ chất được tiêu thụ (hay số mol sản phẩm được tạo thành) trong một đơn vị thời gian.
Định lượng enzym : đo tốc độ xuất hiện của sản phẩm hoặc tốc độ biến mất của cơ chất .
NADH và NADPH là hai phân tử thường được sử dụng để đo sự
thay đổi độ hấp thu trong các định lượng hoạt độ enzym và chúng hấp thu trong vùng tử ngọai ở bước sóng 340 nm.
Thí dụ: đo hoạt độ của lactat dehydrogenase với cơ chất là lactat. - Hoạt độ enzym có thể được định lượng bằng cách đo sự gia tăng của độ hấp thu ở 340 nm với phương trình phản ứng sau:
CH3-CH(OH)-COO- + NAD+ CH3-CO- COO- + NADH + H+
2.2- Định lượng enzym kết hợp Glucose + O2 + H2O Glucose oxydase Acid Gluconic + H2O2 Hợp chất không màu Peroxydase Hợp chất có màu H2O
Định lượng kết hợp enzym giữa glucose oxydase và peroxydase có thể được sử dụng để đo nồng độ glucose trong máu
Nếu muốn định lượng chính xác hoạt độ của enzym đầu tiên (glucose oxydase) thì enzym thứ hai (peroxydase) và những đồng cơ chất cũng như các coenzym của chúng phải có một
lượng thừa để không rơi vào “bước chậm” làm ảnh hưởng đến vận tốc của enzym kết hợp.
Trong những điều kiện này, tốc độ tạo ra hợp chất có màu tỷ lệ với tốc độ tạo H2O2 và chính tốc độ này tỷ lệ với hoạt độ của glucose oxydase.
2.3- Vận tốc phản ứng enzym
Vận tốc của phản ứng được xúc tác bởi enzym thường
được gọi là tốc độ của phản ứng.
Vận tốc phản ứng enzym thường liên quan đến giá trị của
vận tốc khởi đầu, ở thời điểm zero (biểu thị Vo,
mol/phút) .
Vo : vận tốc cao nhất (chưa có sản phẩm được thành lập ở thời điểm đó)
Ngoài ra, enzym có thể là đối tượng chịu sự ức chế ngược bởi chính sản phẩm của phản ứng và/hoặc trong phản ứng nghịch, các sản phẩm có thể là nguồn nguyên liệu cho chúng.
Sự liên quan giữa việc tạo thành sản phẩm theo thời gian trong phản ứng được xúc tác bởi enzym
Sản phẩm (mol) t (min) Vo °° ° ° ° ° ° ° ° °
Vo tương ứng với độ dốc của đường thẳng tuyến tính đi qua tọa độ gốc
Biểu thị đơn vị hoạt độ enzym :
Thông thường bằng vận tốc ban đầu (Vo) của phản ứng được xúc tác (thí dụ : bằng mol cơ chất được chuyển hóa trong 1 phút).
2 đơn vị tiêu chuẩn khác cho hoạt độ của enzym là đơn vị enzym (U) và katal (kat) .
- U : lượng enzym cần thiết để xúc tác việc chuyển 1 mol cơ chất trong 1 phút ở 25 độ C trong những điều kiện tối ưu của enzym này.
- Katal là đơn vị tiêu chuẩn quốc tế SI đo hoạt độ enzym được định nghĩa như là tác động xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng của một mol/giây trong một hệ thống đặc hiệu.
Sự chuyển đổi giữa những đơn vị
1 mol/phút = 1U = 16,67 nanokat
- Hoạt độ (hay hoạt độ tổng cộng) là tổng số đơn vị hoạt động enzym của một mẫu
- Hoạt độ đặc hiệu là số đơn vị hoạt động enzym tương ứng với 1mg protein (U/mg).
- Hoạt độ đặc hiệu dùng để đánh giá mức độ tinh khiết của enzym. Trong quá trình tinh chế enzym, hoạt độ đặc hiệu của nó tăng và tiến tới tối đa và không đổi khi enzym hoàn toàn tinh khiết.
Mối liên quan giữa {S} và Vo 2.4- Nồng độ cơ chất °° ° ° ° ° ° ° ° ° Vo {S}
Đối với những nồng độ thấp của cơ chất thì khi tăng gấp đôi cơ chất sẽ dẫn đến việc tăng gấp đôi tốc độ ban đầu (Vo).
Đối với những nồng độ cao của cơ chất, enzym đã bị bảo hòa va øsự tăng [S] thêm sẽ chỉ làm tăng rất ít Vo.
Biểu đồ biễu thị mối liên quan giữa Vo theo [S] là một đồ thị dạng hyperbol
2.5- Nồng độ enzym
Khi nồng độ cơ chất bảo hòa, một sự tăng gấp đôi nồng độ enzym dẫn đến việc tăng gấp đôi Vo.
Nếu biểu diễn bằng đồ thị sự thay đổi của Vo theo nồng độ enzym, ta sẽ có một đường thẳng.
2.6- Nhiệt độ Hai khả năng :
Gia tăng nhiệt độ : tăng năng lượng nhiệt cung cấp cho các phân tử cơ chất gia tăng vận tốc của phản ứng
Ở những nhiệt độ quá cao nguy cơ phá vỡ các liên kết yếu không đồng hóa trị (liên kết hydrogen, lực Van der Walls….) là những liên kết làm ổn định cấu trúc không gian ba chiều của enzym biến tính enzym.
Chỉ cần có một thay đổi nhỏ trong cấu hình 3 chiều của
enzym cũng làm thay đổi cấu trúc của TTHĐ: giảm
4 37 50Vo Vo
oC
Tác động của nhiệt độ phản ứng trên hoạt độ enzym
Tác động chung của sự gia tăng nhiệt độ trên vận tốc phản ứng của enzym tạo ra hai hiệu ứng ngược nhau.
Đối với loài hữu nhũ, nhiều enzym hoạt động ở nhiệt độ gần 37 độ C.
Taq polymerase tham gia trong phản ứng trùng hợp chuỗi có trong vi khuẩn sống ở các nguồn nước nóng và enzym này thích nghi họat động trong những điều kiện nhiệt độ cao.
2.7- pH
Mỗi một enzym có một pH tối ưu mà ở pH này vận tốc của phản ứng xúc tác sẽ đạt tối đa.
Một thay đổi nhỏ của pH so với giá trị tối ưu cũng dẫn đến sự giãm hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của các nhóm chức trong TTHĐ của enzym.
Một sự thay đổi lớn pH có thể làm biến tính protein
enzym do ảnh hưởng đến các liên kết yếu không đồng
Sự thay đổi của vận tốc Vo theo pH dưới dạng hình chuông pH 5 6 4 7 8 9 Vo Enzym 1 Enzym 2 Nhiều enzym có pH tối ưu khoảng 6,8
Pepsin là một enzym tiêu hóa hoạt động trong dạ dày ở pH acid (pHkhoảng 2) :
phụ thuộc vào môi trường hoạt động
2.8- Coenzym và các nhóm ngoại
- Để xúc tác một phản ứng, nhiều enzym cần có sự hiện diện của những tiểu đơn vị không phải là protein được gọi là chất cộng tác hay cofactor.
- Các chất cộng tác này có thể là một hay nhiều ion vô cơ như Zn 2+ hay Fe2+, hoặc có thể là một phức hợp các phân tử hữu cơ được gọi là coenzym : nhóm ngoại (Thí dụ Hem trong phân tử Hemoglobin).
- Holoenzym : dạng có hoạt tính xúc tác hoàn chỉnh của một enzym phối hợp với coenzym của nó hay với ion kim loại của chúng.
COENZYM + APOENZYM HOLOENZYM
Một số coenzym, chẳng hạn NAD+ , được gắn với enzym rồi tiếp đến lại được giải phóng ra khỏi enzym trong quá trình xúc tác và đóng vai trò như là một chất đồng cơ chất.
Nhiều coenzym là những dẫn xuất từ các tiền chất là các vitamin.
Coenzym Tiền chất Bệnh do thiếu vitamin Coenzym A FAD, FMN NAD+, NADP+ Thiamine pyrophosphat Tetrahydrofolat Desoxyadenosyl cobalamin Đồng cơ chất trong sự hydroxyl hóa Prolin thành collagen Pyridoxal phosphat Acid pantothenic Riboflavine (vitamin B2) Niacine Thiamine (vitamin B1) Acid folic Cobalamin (vitamin B12) Vitamin C (acid ascorbic)
Pyridoxin (vitamin B6) Viêm da Chậm lớn Pellagre Tê phù (Béri-béri) Thiếu máu Thiếu máu ác tính Scorbut Viêm da
Nicotinamide adenin dinucleotid (NAD+) và nicotinamide adenin dinucleotid phosphat (NADP+) là hai coenzym mà cấu trúc gồm có một base Adenin, hai đường ribose, glucid được liên kết với nhau bởi nhóm phosphat và một nhân nicotinamid.
NADP+ khác với NAD+ do có thêm một nhóm phosphat gắn với một phân tử ribose
Chức năng giống nhau : hoạt động như những chất vận chuyển điện tử và tham gia vào các phản ứng oxy hóakhử.
NAD+ thường được sử dụng trong các phản ứng dị hóa (phân hủy) trong khi NADP+ tham gia vào các phản ứng đồng hóa (sinh tổng hợp).
Phần hoạt động của hai phân tử : nhân nicotinamid (dạng oxy hóa hay dạng khử ) hoạt động bằng cách nhận hay cho điện tử tùy theo phản ứng enzym.
Phản ứng kéo theo cũng là sự vận chuyển proton theo
phương trình sau :
Cấu trúc của coenzym NAD+ và NADP+ N CONH2 OH HO CH2 O P O O O P O O O CH2 O HO O P O O- -O ADENIN N R CONH2 H H NAD+ NADP+ NADH/NADPH 2è + H+ 2è + H+
Flavin adenin dinucleotid (FAD) và flavin mononucleotid (FMN) cũng là những chất chuyển vận điện tử và có cấu trúc hóa học gần nhau
Mỗi một coenzym này được thành lập bởi một đơn vị
flavin mononucleotid có chứa trung tâm hoạt động. FAD
có chứa thêm một nhóm bổ sung glucid (Ribose) và
Adenin.
FAD và FMN tác động với 2 proton và 2 điện tử để
chuyển luân phiên từ trạng thái khử sang trạng thái oxy hóa
NN N N NH CH3 CH3 O O CH2 CHOH CHOH CHOH CH2 O P O O O P O O O CH2 HO OH N N N NH CH3 CH3 O O R H H FMN FAD 2è + 2H+ 2è + 2H+
Cấu trúc của coenzym FAD và FMN
2.9- Các isoenzym
Isoenzym (isozym) : dạng khác nhau của một enzym xúc tác cùng một phản ứng nhưng chúng có những tính chất động học và vật lý khác nhau ( như điểm đẳng điện, pH tối ưu, ái lực đối với cơ chất hay đối với những tác động của các chất ức chế)
Những isoenzym khác nhau của một enzym nhất định
được tổng hợp do những gen khác nhau và thường tác động trong những mô khác nhau của cơ thể.
Ví dụ :
Lactat dehydrogenase (LDH) : cấu tạo bởi bốn tiểu đơn vị
xuất phát từ hai lọai tiểu đơn vị khác nhau gọi là H và M.
Hai loại này có những khác nhau nhỏ trong trình tự chuỗi acid amin của chúng.
Hai loại tiểu đơn vị này có thể kết hợp một cách ngẫu nhiên để tạo nên 5 isoenzym có cấu tạo là H4, H3M, H2M2, HM3 và
M4.
Tiểu đơn vị M có nhiều trong cơ xương (cơ vân) và gan trong khi H có nhiều trong tim. Các isoenzym H4 và H3M có nhiều trong tim và hồng cầu; H2M2 trong não và thận, trong khi đó HM3 và M4 có nhiều trong gan và cơ xương.
Ý nghiã của isoenzym
cấu trúc của mỗi isoenzym thì đặc trưng cho một mô đặc hiệu.
ý nghĩa to lớn trong y học
một công cụ để chẩn đoán (dùng chẩn đoán nhồi máu cơ tim , theo dõi tiến triển của quá trình trị liệu)
3-ĐỘNG HỌC VAØ SỰ ỨC CHẾ ENZYM
3.1- Mô hình Michaelis-Menten
Mô hình Michaelis-Menten tóm tắt khái niệm sau đây về sự xúc tác của một phản ứng bởi enzym
k3 k2
k1
E + S ES E + P
Các hằng số vận tốc k1, k2 và k3 biểu thị cho vận tốc ở mỗi bước khác nhau trong quá trình xúc tác.
Chấp nhận rằng vận tốc của phản ứng ngược lại E + P ---> ES không có ý nghĩa.
Nghiên cứu động học của một số enzym:
ở những nồng độ cơ chất thấp, vận tốc ban đầu (Vo) tỷ lệ trực tiếp với [S]
trái lại đối với những nồng độ cao của cơ chất thì vận tốc có xu hướng đạt đến giá trị tối đa và không phụ thuộc vào [S]. Vận tốc tối đa này được gọi là Vmax (mol.min –1)
Phương trình Michaelis và Menten:
Phương trình được biểu thị dưới dạng đồ thị hyperbol