- Kết quả xác định vi khuẩn Xoo bằngPCR:
4.4. Kết quả xác định đa dạng các mẫu vi khuẩn Xoo bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng đẳng đơn gen
lây nhiễm nhân tạo trên các dòng đẳng đơn gen
Quá trình bảo quản và cấy chuyển các mẫu vi khuẩn có thể làm cho hoạt tính của các mẫu vi khuẩn bị giảm hoặc mất đi. Điều này sẽ ảnh hưởng đến kết quả của phương pháp. Để kiểm nghiệm, chúng tôi đã tiến hành lây nhiễm các mẫu vi khuẩn trên cả giống đối chứng mẫn cảm IR24 và các dòng đẳng đơn gen. Những mẫu Xoo cho kết quả nhiễm với IR24 thì được xác định là độc tính vẫn ổn định. Kết quả lây nhiễm được biểu diễn ở bảng 5, phần phụ lục bảng. Với d (cm) là chiều dài trung bình của vết bệnh thì:
d < 8 = kháng, kí hiệu R
8 < d < 12 = kháng TB hoặc nhiễm TB, kí hiệu M. d > 12 = nhiễm S
Bảng 7. kết quả đánh giá lây nhiễm nhân tạo – phổ kháng nhiễm BB1 BB2 BB3 BB4 BB5 BB7 BB10 BB14 BB21 IR24 R 1 S S R S R R S S R S 4R/6S R 2 R R R R R R R R R S 9R/1S R 3 R R R R R R R R R S 9R/1S R 5 S M R S R R S M R S 4R/2M/4S R 6 S M M M R R M R R S 4R/4M/2S R 7 S S R M R R S S R S 4R/1M/5S R 8 S S R M R R S M R S 4R/2M/4S R 9 S S S S R S S S M S 1R/1M/8S R 10 S S R S R R S S R S 4R/6S R 11 S S S S R R S S R S 3R/7S R 12 R M R R R R S R R S 7R/1M/2S 2 S S R S R R S S R S 4R/6S 4 S R R R R R R R R S 8R/2S 5 S S R S R R S S R S 4R/6S 8 S S R R R R S S R S 5R/5S 12 R R R R R R R R R S 9R/1S 15 S S R S R R S S R S 4R/6S 4R/13S 4R/3M/10S 14R/1M/2S 6R/3M/8S 17R 16R/1S 4R/1M/12S 6R/2M/9 S 16R/1M 17S Trong đó: S: Nhiễm M: kháng TB R: kháng
Từ kết quả đánh giá ở phổ kháng nhiễm (bảng 7), chúng tôi nhận thấy:
- Ba dòng đẳng đơn gen BB5, BB7, BB21 tương ứng chứa các gen kháng bạc lá xa5, Xa7, Xa21 cho kết quả kháng cao đối với các chủng vi khuẩn
Xoo:
+ BB5 kháng được 17/17 chủng vi khuẩn nghiên cứu kháng 100 %. + BB7 kháng được 16/17 chủng vi khuẩn nghiên cứu kháng 94 %. + BB21 kháng được 16/17 chủng vi khuẩn nghiên cứu kháng 94 %. - Dòng đẳng đơn gen BB14 tương ứng chứa gen kháng Xa14 cho kết quả kháng kém với các mẫu vi khuẩn Xoo. BB14 kháng được 8/17 mẫu vi khuẩn (trong đó kháng trung bình với 2 mẫu vi khuẩn) đạt tỉ lệ kháng là 47 %. - Các mẫu vi khuẩn nhiễm được nhiều dòng đẳng gen nhất là R9 và mẫu R11.
+ Mẫu R9 nhiễm được 7/9 dòng đẳng đơn gen, tỉ lệ nhiễm là 78 %. Nguồn gốc thu thập: trên giống IR 64 tại Thuận Châu, Sơn La.
+ Mẫu R11 nhiễm được 6/9 dòng đẳng đơn gen, tỉ lệ nhiễm 67%. Nguồn gốc thu thập: trên giống Nhị ưu – 838 tại Quỳnh Lưu, Nghệ An.
NTSYSpc2.0 là phần mềm chuyên dụng trong việc phân tích đa dạng di truyền, thường được sử dụng trong những phương pháp đánh giá trên bộ genome như RFLP, RAPD,... Trong đề tài này, vì mục đích có được sự so sánh giữa 2 phương pháp nghiên cứu đa dạng: phương pháp lây nhiễm nhân tạo và phương pháp nghiên cứu với rep-PCR, IS-PCR chúng tôi đã sử dụng phần mềm này để phân tích đối với cả kết quả của phương pháp lây nhiễm nhân tạo. Để thuận tiện cho việc đánh giá đa dạng trên phần mềm NTSYSpc2.0, từ phổ kháng nhiễm chúng tôi đã tiến hành cho điểm như sau:
Nhiễm và kháng trung bình (S và M) = 1; Kháng (R) = 0. Kết quả đánh giá dưới dạng nhị thức được thể hiện tại bảng 6, phần phụ lục bảng.
Xử lí kết quả đánh giá này trên phần mềm NTSYSpc2.0, chúng tôi đã xác định được hệ số tương đồng giữa các mẫu vi khuẩn nghiên cứu (bảng 7, phần phụ lục bảng) và cũng xây dựng được cây phân loại biểu diễn mỗi quan hệ về mặt kiểu hình giữa các mẫu vi khuẩn. (Hình 14).
Hình 14. Cây phân loại theo phổ kháng nhiễm, phân tích bằng NTSYSpc2.0.
Để tiến hành so sánh với kết quả phân loại của phương pháp phân tích đa dạng sử dụng rep-PCR và IS-PCR, chúng tôi đã chọn cùng hệ số tương đồng là 0,95 để có được sự đồng nhất trong tiến hành 2 phương pháp.
Như vậy, bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng đẳng gen, chúng tôi đã phân lập 17 mẫu vi khuẩn Xoo nghiên cứu thành 8 nhóm khác nhau tại hệ số tương đồng là 0,95. Đó là các nhóm:
- Nhóm 1: gồm các mẫu R1, R5, R7, R8, R10, 2, 5. - Nhóm 2: mẫu R11. - Nhóm 6: R2, R3, 12. - Nhóm 3: mẫu 8 - Nhóm 7: mẫu 4 - Nhóm 4: mẫu R6 - Nhóm 8: mẫu R12 - Nhóm 5: mẫu R9. Coefficient 0.54 0.65 0.77 0.88 1.00 R1 R5 R7 15 5 R8 2 R10 R11 8 R6 R9 R2 R3 12 4 R12 0.95