1.4.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.4.1.1. Cơ sở ụ thuyết
HPLC là chữ viết tắt cúa 04 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Perlbrmance Liquid Chromatography),
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-19Ố8 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triên nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiếm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiếm nghiệm thuốc. Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng.
Ưu điểm của HPLC:
Điều kiện phân tích khá dễ dàng.
Dễ dàng thu hồi chất phân tích vói độ tinh khiết cao. Độ lặp lại cao.
Thường không phân hủy mẫu.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp thụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử).
Trong luận văn này chúng tôi sử dụng Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) HITACHI L-5000 detectorDAD
1.4.1.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi
phân tích, kết quả các chất A, B, c.. sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác F1,F2 và F3.
Tống của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (Fl) và ngược lại.
Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực Fl, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hương không lớn. Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột.
1.4.1.3 Phân loại sắc ký và ứng dụng
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh, yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động đê kéo chất tan ra khỏi cột.
Chất phân tích A + B + c
- Sắc ký hấp phụ (NP-HPLC và RP-HPLC). - Sắc ký phân bố - sắc ký chiết (LLC). - Sắc ký trao đổi ion (IE-HPLC).
Nhimg thực tế hiên nay, chúng ta hiện chỉ đang ímg dụng sắc ký' hấp phụ
vào phân tích mẫu. sắc ký hấp phụ là quá trình sắc ký' dựa trên sự hấp phụ mạnh
yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) của pha động đế kéo chất tan ra khỏi cột. Sự tách một hỗn họp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ. Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:
Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực.
Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực.
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi, thành công đê tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu hay trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ nhiệt giảm đau. Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP).
1.4.1.4. Các đại ỉưọng đặc trung của sắc kỷ đồ
Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký' đồ. Từ các thông số của các pic, nhiều đại lượng đặc trưng về lý thuyết được đưa ra đế đánh giá một quá trình sắc ký. Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đối các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký.
1.4.1.4.1. Thời gian Um: Retention time (tỵ)
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
5,5
4 16 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
U V ^0. { W
25
Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.Trong một phép phân tích nếu Rt nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu Rt quá lớn thỉ peak bị dán và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Đe thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên.
1.4.1.4.2. Hệ so dung lượng K
- Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó
trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điẻm cân bằng..
Thường được tính theo công thức sau:
- Hệ số dung lượng k phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tính của pha tĩnh và pha động.
K = I
tn tn tn
0 0 0
Nếu K nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. K lớn thì pic bị loãng, độ nhạy kém. Trong thực tế k từ 1 đến 5 là tối ưu.
1.4.1.4.3. Độ chọn lọc a
Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí. Khi hai chất A, B có K A và K B khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biếu thị ở độ chọn lọc a
a = K’A/K’B (K A > K
26
giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và pha động. Vì vậy với một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định.
Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích