Số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và Statghaphics XVII.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập nấm men
Kết quả thu được 40 chủng nấm men thuần từ 12 nguồn mẫu men cơm rượu thu thập từ chợ ở các địa điểm: huyện Châu Phú và TP Long Xuyên, tỉnh An Giang; TP Bạc Liêu, tỉnh Bạc Liêu; TP Cà Mau, tỉnh Cà Mau; quận Ninh Kiều, quận Ơ Mơn và quận Thốt Nốt, TP Cần Thơ; Huyện Lấp Vị, tỉnh Đồng Tháp; huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang; thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sĩc Trăng ; huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh; huyện Trà Ơn, tỉnh Vĩnh Long. Nguồn mẫu đa dạng nên các chủng nấm men khá đa dạng về mặt di truyền, với nhiều chủng nấm men cĩ hình dạng, kích thước khác nhau, các chủng nấm men được ký hiệu: AA1, AG5, AG1, AG1.1, AG2, AG3.3, BD1, BD2, BL1, BL2, BL3, BL4, CM2, CM2.2, CM3, CM4.4, CT1, CT2, DT1, DT2, HG1, HG2, NK2, NK4, OM1, OM2, OM3, OM4, ST1, ST2, TB1, TG1, TNN3, TNN4, TO1, TO2, TV1, TV2, TV3, TV4.
a. Huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
Ghi chú: (9a): AG1, (9b): AG1.1, (9c): AG2, (9d): AG3
[Type a quote from the document or the summary of an interesting point. You can position the text box anywhere in the document. Use the Drawing Tools tab to change the formatting of the pull quote text box.]
9c 9d
Hình 9: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Châu Phú, An Giang
b. Thành phố Long Xuyên, An Giang
Ghi chú: (10a): AA1, (10b) : AG5
c. Thành Phố Bạc Liêu, tỉnh Bạc Liêu
Ghi chú: (11a): BL1, (11b): BL2, (11c): BL3, (11d): BL4
Hình 10: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Thành phố Long Xuyên, An Giang
10a 10b
Hình 11: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Thành phố Bạc Liêu
11c 11d
d. Thành phố Cà Mau, tỉnh Cà Mau
Ghi chú :(12a): CM2.2, (12b): CM2, (12c): CM3, (12d): CM4.4
e. Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ
13a 13b
Hình 13: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ
Ghi chú: (13a): NK2, (13b): NK4
12c 12d
Hình 12: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Phường 2, TP Cà Mau
f. Quận Ơ Mơn, Thành phố Cần Thơ
14a 14b
14c 14d
Hình 14: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Ơ Mơn, Thành phố Cần Thơ
g. Quận Thốt Nốt, Thành phố Cần Thơ
15a 15b
15c 15d
Hình 15: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Thốt Nốt, Thành phố Cần Thơ
Ghi chú: (15a) TNN3, (15b): TNN4, (15c): CT1, (15d): CT2
h. Huyện Lấp Vị, tỉnh Đồng Tháp
16a 16b
Hình 16: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Lấp Vị, Đồng Tháp
i. Huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang
17a 17b
17c 17d
Hình 17: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Phụng Hiệp, Hậu Giang
j. Thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sĩc Trăng
18a 18b
18c 18d
Hình 18: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Vĩnh Châu, Sĩc Trăng
Ghi chú: (18a): ST1, (18b): ST2, (18c): BD1, (18d): BD2
k. Huyện Trà Ơn, tỉnh Vĩnh Long
19a 19b
Hình 19: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Trà Ơn, Vĩnh Long
l. Huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh
20a 20b
20c 20d
Hình 20: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Trà Cú, Trà Vinh
Ghi chú: (20a): TV1, (20b): TV2, (20c): TV3, (20d): TV4
4.2. Đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hĩa của nấm men
Theo Nguyễn Lân Dũng (1998) và Nguyễn Đức Lượng et al. (2004) cĩ thể định danh sơ bộ các chủng nấm men dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý của nấm men. Đặc điểm hình thái gồm: mơ tả hình thái tế bào nấm men khi nuơi cấy trên mơi trường PGA 2 ngày, sự hình thành tế bào nảy chồi và kiểu nảy chồi khi nuơi cấy trên mơi trường dịch thể peptone – cao nấm men – glucose sau thời gian 2 đến 3 ngày ủ. Đặc điểm sinh lý gồm: khả năng lên men đường và khả năng đồng hĩa urea (hoạt tính enzyme urease) của nấm men.
a. Đặc điểm hình thái nấm men
Hình thái chung của các chủng nấm men gồm các dạng sau:
40 chủng nấm phân lập được đa dạng về hình dạng, kích thước. Các khuẩn lạc nấm men cĩ dạng lồi, đường kính khoảng 1-3 mm và độ dày 0,1 mm. Bề mặt một số
khuẩn lạc trơn bĩng hoặc sần. Các khuẩn lạc cĩ dạng bìa chủ yếu là dạng bìa nguyên, cĩ sợi, tỏa tia hoặc chia thùy. Về màu sắc, hầu hết các khuẩn lạc đều cĩ màu trắng sữa hoặc trắng đục. Hình dạng của một số khuẩn lạc điển hình của các chủng nấm men được thể hiện trong Hình 21.
21a 21b
21c 21d
Hình 21:Hình dạng một số khuẩn lạc điển hình
Ghi chú: (21a): HG2, (21b): CT2, (21c): BL4, (21d): TNN4
Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của tế bào nấm men dưới kính hiển vi cho thấy hình dạng các tế bào rất đa dạng, chủ yếu gồm: hình cầu, ovan và hình ellipse. Kích thước của các tế bào nấm men dao động từ 5-15 µm và chiều rộng nằm trong khoảng 2-10 µm. Dựa vào đặc điểm hình thái của các tế bào nấm men, cĩ thể chia 40 chủng nấm men đã phân lập được thành 5 nhĩm chính. Các nhĩm và tên chủng được thể hiện trong Bảng 1.
Bảng 1: Các dạng nấm men đã phân lập Tên
nhĩm
Hình dạng tế
bào nấm men Tên các chủng
Số lượng chủng
Nhĩm 1 Cầu lớn AA1, BD1, CM2.2, DT1, ST2, TB1,
TG1, TNN3 8
Nhĩm 2 Ovan lớn DT2, CT1, HG2, ST1, TO1 5
Nhĩm 3 Ovan nhỏ AG1, BD2, BL4, CM3, TO2, OM1 6
Nhĩm 4 Ellipse lớn AG5, AG1.1, AG3.3, OM3, CT2, HG1,
AG2, TV1, TV4 9
Nhĩm 5 Ellipse nhỏ BL1, BL2,BL3, CM2, CM4.4, OM2,
OM4, TV2, TV3, NK2, NK4, TNN4 12
Tổng số 40
Hình dạng chủ yếu của các nhĩm tế bào được thể hiện trong Hình 22
Hình 22: Hình dạng điển hình của 5 nhĩm nấm men ở vật kính X100 Nhĩm 3: Ovan nhỏ
Nhĩm 4: Ellipse lớn Nhĩm 5: Ellipse nhỏ
Đặc điểm cụ thể về hình thái của từng chủng nấm men được liệt kê một cách chi tiết trong Bảng 2.
Bảng 2: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men đã phân lập
Stt Tên
mẫu
Mơ tả khuẩn lạc Đặc điểm tế bào
Đường kính (mm) Độ dày (mm) Lồi/lõm Bề mặt, dạng bìa Màu sắc Kích thước (µm) Hình dạng
1 AA1 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x10 Cầu lớn
2 AG5 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x5 Ellipse
lớn
3 AG1 2-2,3 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 6x5 Ovan
nhỏ
4 AG1.1 2-2,4 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x5 Ellipse
lớn
5 AG2 1-1,5 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên Trắng 10x5 Ellipse
lớn
6 AG3.3 2-2,2 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên
tỏa tia Trắng 10x5
Ellipse lớn
7 BD1 1,5-2 0,1 Lồi Sần, bìa chia
thùy, cĩ tỏa tia Trắng 10x10 Cầu lớn
8 BD2 2-2,3 0,1 Lồi Sần, bìa chia
thùy, cĩ tỏa tia Trắng 4x3
Ovan nhỏ
9 BL1 1,5-2 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 5x3 Ellipse
nhỏ
10 BL2 1,5-2 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên Trắng 4x3 Ellipse
nhỏ
11 BL3 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa sợi Trắng 7x3 Ellipse
nhỏ
12 BL4 1,5-2 0,1 Lồi Sần, bìa răng
cưa, cĩ sợi Trắng 4x2
Ovan nhỏ
13 CM2 1,5-2 0,1 Lồi Sần, bìa răng
cưa, cĩ sợi Trắng 6x3
Ellipse
nhỏ
14 CM2.2 1,5-2 0,1 Lồi Sần, bìa sợi Trắng 8x8 Cầu lớn
15 CM3 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa răng
cưa, tỏa tia Trắng 4x3
Ovan nhỏ
16 CM4.4 1-1,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 6x2 Ellipse
17 CT1 1-1,5 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên Trắng 12x12 Cầu lớn
18 CT2 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 12x5 Ellipse
lớn
19 DT1 2-2,6 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên
cĩ sợi Trắng 9x9 Cầu lớn
20 DT2 2-2,3 0,1 Lồi Sần, bìa răng cưa
cĩ sợi Trắng 8x7
Ovan lớn
21 HG1 1,5-2 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x5 Ellipse
lớn
22 HG2 1-2 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên
cĩ sợi Trắng 10x8
Ovan lớn
23 NK2 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 8x4 Ellipse
nhỏ
24 NK4 1,5-2 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên
cĩ sợi Trắng 6x4
Ellipse nhỏ
25 OM1 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa tỏa tia Trắng 3x2 Ovan
nhỏ
26 OM2 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 5x3 Ellipse
nhỏ
27 OM3 1-2 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên
cĩ sợi Trắng 10x5
Ellipse
lớn
28 OM4 2-2,5 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên Trắng 6x4 Ellipse
nhỏ
29 ST1 1,5-2 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 8x7 Ovan
lớn
30 ST2 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên
tỏa tia Trắng 10x10 Cầu lớn
31 TB1 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x10 Cầu lớn
32 TG1 1-2 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên Trắng 13x13 Cầu lớn
33 TNN3 1,5-2 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên Trắng 12x12 Cầu lớn
34 TNN4 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 7x4 Ellipse
nhỏ
35 TO1 1,5-2 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 8x7 Ovan
nhỏ
36 TO2 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên
tỏa tia Trắng 6x5 Ovan
nhỏ
37 TV1 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên
cĩ sợi Trắng 13x6
Ellipse lớn
38 TV2 1-1,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên
cĩ sợi Trắng 8x4
Ellipse nhỏ
39 TV3 1-2 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 7x4 Ellipse
nhỏ
40 TV4 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x6 Ellipse
lớn
b. Kiểm tra hoạt tính sinh lý
Kiểm tra khả năng lên men đường glucose, saccharose và maltose:
Kết quả kiểm tra định tính của 40 chủng nấm men phân lập cĩ thể xếp thành 3 nhĩm: nhĩm I (cĩ khả năng lên men đường), nhĩm II (cĩ khả năng lên men đường yếu) và nhĩm III (khơng cĩ khả năng lên men đường) được thể hiện ở Bảng 3.
Bảng 3: Khả năng lên men 3 loại đường của các chủng nấm men
Loại đường Nhĩm I Nhĩm II Nhĩm III
Đường glucose
AA1, AG5, AG1, AG1.1, AG2, BD2, BL1, BL2, BL3, BL4, CM2, CM2.2, CM3, CM4.4, CT1, DT1, DT2, HG1, HG2, NK2, NK4, OM1, OM2, OM4, TB1, TG1, TNN3, TNN4, TO1, TO2, TS2,TV1, TV2. AG3.3, BD1, CT2, OM3, ST2, TV3, TV4. Đường saccharose AA1, BL1, BL2, CM2.2, CM4.4, CT1, DT1, DT2, HG2, ST2, TB1, TG1, TNN3, TNN4, TO1. , AG5, AG1.1, AG2, AG3.3, BD1, BL3, BL4, CM2, CT2, HG1, NK2, NK4, OM2, OM3, OM4, TV1, TV2, TV3, TV4. AG1, BD2, BL4, CM3, OM1, TO2. . Đường mantose
AA1, AG1, AG1.1, AG3.3, BD1, BD2, BL1, BL2, BL3, BL4, CM2, CM2.2, CM3, CM4.4, CT1, CT2, DT1, DT2, HG2, NK2, NK4, OM1, AG5, AG2, HG1, ST2, TV1, TV4.
OM2, OM3, OM4, TB1, TG1, TNN3, TNN4, TV2,
TV3, TO1, TO2, TS2.
Kết quả cho thấy tất cả các chủng nấm men đều cĩ khả năng sử dụng đường maltose và glucose. Trong khi đĩ, cĩ 6/40 chủng nấm men thuộc nhĩm 3 khơng cĩ khả năng sử dụng đường saccharose. Glucose là một loại đường cơ bản, cấu trúc dễ phá vỡ nhất nên hầu hết các chủng nấm men đều sử dụng được. Maltose là loại đường cĩ độ ngọt kém hơn saccharose và dễ bị thủy phân bởi enzyme glucosidase tạo ra 2 phân tử đường glucose, do đĩ những chủng nấm men sử dụng được loại đường này đều cĩ khả năng tạo ra enzyme glucosidase. Saccharose là loại đường khá phổ biến trong tự nhiên, để sử dụng loại đường này cần cĩ enzyme Invertase, do đĩ 34/40 chủng nấm men sử dụng được đường saccharose đều cĩ khả năng tạo ra enzyme invertase và 6/40 chủng nấm men khơng cĩ khả năng tạo ra enzyme invertase.
Khả năng lên men các loại đường của nấm men là một đặc tính quan trọng. Trong quá trình sản xuất ethanol. Do đĩ, việc kiểm tra khả năng sử dụng các loại đường của nấm men sẽ là một trong những tiêu chí phân loại nấm men, đồng thời là bước đầu chọn lọc ra những chủng nấm men phù hợp cho lên men các loại cơ chất khác nhau nhằm tận dụng triệt để hơn nguồn đường trong cơ chất, bởi thành phần và tỷ lệ các loại đường trong từng loại cơ chất là rất khác biệt.
Kiểm tra khả năng đồng hĩa urea (hoạt tính enzyme urease) của các chủng nấm men phân lập được. .
a b c
d e
Hình 23: dung dịch urea trước và sau 48 giờ ủ
*Ghi chú: (23a): Dung dịch Urea trước khi chủng nấm men
(23b), (23c), (23d): Dung dịch Urea sau khi chủng nấm men và ủ 48 giờ (23e): Đối chứng âm (bên phải) và đối chứng dương (bên trái)
Bảng 4 thể hiện kết thử hoạt tính enzyme urease của các chủng nấm men.
Bảng 4: Hoạt tính enzyme urease của các chủng nấm men sau 48 giờ
Kết quả Dương tính (+) Âm tính (-)
Tên các chủng BL2, BL1, HG1. AA1, AG5, AG1, AG1.1, AG2, AG3.3, BD1, BD2, BL3, BL4, CM2, CM2.2, CM3, CM4.4, CT1, CT2, DT1, DT2, HG2, NK2, NK4, OM1, OM2, OM3, OM4, ST1, ST2, TB1, TG1, TNN3, TNN4, TO1, TO2, TV1, TV2, TV3, TV4.
Số lượng 3/40 37/40
Ghi chú: Dấu “+” mơi trường chuyển sang màu hồng, dấu “-” mơi trường khơng chuyển màu. Giá trị ghi trong
Hagler và Ahearn (1981) đã nghiên cứu và đưa ra kết luận, đa số các chủng thuộc chi nấm men sinh nang bào tử thường ít cĩ khả năng phân giải urea, cịn các lồi thuộc chi sinh bào tử như Cryptococcus và Rhodotorula thì lại cĩ khả năng này. Tuy nhiên, Schizosaccharomyces pombe và các lồi thuộc chi Lipomyces là những ngoại lệ, mặc dù chúng thuộc nhĩm nấm men sinh nang bào tử nhưng vẫn cĩ khả năng phân giải urea cĩ trong mơi trường sống. Một số lồi thuộc giống Schizosaccharomyces và chi Yarrowia lipolytica cũng cĩ khả năng đồng hĩa urea (Barnett et al., 1983; Kreger- van Rij, 1984). Các lồi thuộc chi Candida cũng cĩ khả năng phân giải tốt urea (Moore, 1980; Weijman et al. 1988). Theo Booth và Vishniac (1987), sự hiện diện của enzyme urease đĩng vai trị chủ yếu trong việc phân giải urea của nấm men. Trong mơi trường Urea Broth cĩ chất chỉ thị màu phenol red, với pH khoảng 6,8 ± 0,2 thì mơi trường cĩ màu vàng cam. Tuy nhiên, khi chủng nấm men nào cĩ khả năng tiết urease thì enzyme này sẽ phân giải urea tạo thành CO2 và NH3. Việc tạo thành NH3 sẽ làm cho pH của mơi trường tăng lên và mơi trường chuyển sang màu hồng. Urea sẽ đĩng vai trị như một nguồn cung cấp nitơ cho lồi nấm men nào cĩ khả năng phân giải chúng (Andrew et al., 1984).
Định danh sơ bộ các chủng nấm men
Dựa vào việc kiểm tra các đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý và sinh hĩa, các chủng nấm men cĩ thể được định danh sơ bộ dựa vào một số đặc điểm sau:
- Đặc điểm hình thái: hình thái, kích thước khuẩn lạc và tế bào nấm men, khả năng nẩy chồi và hình thành bào tử của tế bào nấm men.
- Đặc tính sinh lý, sinh hĩa: khả năng lên men đường saccharose và maltose, khả năng phân giải urea.
Theo nghiên cứu của Kreger-van Rij (1984), mơ tả phân loại sơ bộ đến cấp độ giống của Kurtzman và Fell (1998), cùng với mơ tả phân loại nấm men của Lương Đức Phẩm (2006) và các chương phân loại nấm men trong quyển “The Yeast, a Taxonomic study” (Kurtzman et al., 2011), một số nhĩm nấm men được mơ tả sơ bộ như sau:
Chi Saccharomyces: tế bào cĩ hình cầu, ellipse hoặc ovan, sinh sản bằng nẩy chồi, chồi con mọc từ nhiều hướng, hình thành từ 1-4 bào tử trong nang, lên men các loại đường tốt, nhưng khơng đồng hĩa được nitrate. Một số lồi cĩ khả năng sinh protease
Chi Kluyveromyces: tế bào hình ovan, ellipse, hình trụ hoặc kéo dài, sinh sản bằng nảy chồi từ nhiều hướng, cĩ khả năng hình thành tối đa đến 4 bào tử trong nang, lên men được đường glucose và một số lồi thuộc chi này cĩ thể lên men được các loại đường khác. Tuy nhiên, đa số các lồi thuộc giống này khơng cĩ khả năng phân giải gelatin và cũng ít cĩ khả năng đồng hĩa urea.
Chi Candida: tế bào cĩ hình ovan hoặc hình trụ, sinh sản bẳng nảy chồi từ nhiều hướng, đa số các lồi thuộc chi này cĩ khả năng lên men nhiều loại đường. Đồng thời, một số lồi cĩ khả năng sinh gelatinase, nhưng đa số các lồi thuộc giống này khơng cĩ khả năng đồng hĩa urea.
Chi Hanseniaspora: Tế bào thường cĩ kích thước nhỏ, hình ellipse nhọn hoặc
hình quả chanh. Sinh sản bằng nảy chồi lưỡng cực hoặc nảy chồi 1 đầu. Bào tử được
hình thành trong nang và thường là 1-4 bào tử. Cĩ thể lên men glucose, nhưng hiếm
khi lên men các loại đường khác. Từ các dữ liệu trên, các chủng nấm men đã phân lập
