3.1.1. Địa điểm nghiên cứu
Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện nghiên cứu và Phát triển Cơng Nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ tháng 06 đến tháng 11 năm 2014.
3.1.3. Nguyên liệu
Dịch rỉ đường (mua ở nhà máy đường Phụng Hiệp, thị trấn Ngã Bảy, tỉnh Hậu Giang).
Men cơm rượu thu thập từ chợ ở các địa điểm: Huyện Châu Phú và TP Long Xuyên, tỉnh An Giang ; TP Bạc Liêu, tỉnh Bạc Liêu; TP Cà Mau, tỉnh Cà Mau; Quận Ninh Kiều, quận Ơ Mơn và quận Thốt Nốt, TP Cần Thơ; Huyện Lấp Vị, tỉnh Đồng Tháp; Huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang; Thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sĩc Trăng; Huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh; Huyện Trà Ơn, tỉnh Vĩnh Long.
3.1.4. Dụng cụ, thiết bị
Buồng đếm hồng cầu
Cân phân tích (Ohaus Corp, ARA520, Mỹ)
Kính hiển vi quang học (Olympus Optical, BH-2¸ Nhật) Máy Vortex (HEIPOLPH, Đức)
Nồi thanh trùng (Breukelen, Hà Lan) Tủ cấy vơ trùng
Tủ ủ (Henrich, Đức)
Water bath & Shaker (GESELLSCHAFT, Đức)
Các dụng cụ thơng thường: ống nghiệm, pipet, bình tam giác, ống đong, đĩa petri f100mm,...
3.1.5. Hĩa Chất a. Mơi trường a. Mơi trường
YPD agar: 2% D-glucose, 2% agar, 0,5% yeast extract, 0,5% peptone, cho thêm tetracyclin 50mg/500 mL dung dịch mơi trường.
b. Các hĩa chất khác
C2H5OH, NaCl, NaHSO3, NaOH, HCl,...
3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Phân lập nấm men 3.2.1. Phân lập nấm men
Mục đích: chọn ra những chủng nấm men thuần chủng cĩ trong men cơm rượu.
Phương pháp tiến hành
- Nuơi tăng sinh khối: Cân 1g bánh men rồi nuơi tăng sinh khối trong mơi trường YPD broth (2% D-glucose, 0,5% yeast extract, 0,5% peptone) trong 48 giờ trên máy lắc.
- Phân lập:
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa sẵn 9 mL nước muối sinh lý vơ trùng, đánh dấu số thứ tự, tiến hành hút 1 mL dung dịch đã nuơi tăng sinh cho vào ống nghiệm 1 thu được nồng độ pha lỗng 10-1, tiếp theo hút 1 mL dung dịch pha lỗng từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2 thu được nồng độ pha lỗng 10-2. Cứ tiếp tục hút 1 mL dung dịch pha lỗng trước cho vào 9 mL nước muối sinh lý ta thu được dung dịch cĩ độ pha lỗng cao hơn. Đảo trộn dung dịch nhiều lần bằng micropipet trước để đồng nhất mẫu, sâu đĩ hút 0,1 mL dung dịch đã pha lỗng, trải đều lên mơi trường thạch nuơi cấy trong đĩa petri, nuơi cấy trong tủ ấm 30oC sau 24 giờ đến 48 giờ.
Sau 24-48 giờ các khuẩn lạc đặc trưng xuất hiện trên mặt thạch. Sau đĩ tiến hành tách các khuẩn lạc khác nhau cấy chuyền sang đĩa thạch petri khác tạo giống thuần chuẩn.
Giống thuần chủng được giữ giống trong thạch nghiên và giữ trong tủ lạnh. Các thao tác luơn được đảm bảo vơ trùng.
3.2.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hĩa của nấm men a. Đặc điểm hình thái
Mục đích: xác định các đặc tính về hình dạng và kích thước của khuẩn lạc và tế bào nấm men đã phân lập được.
Cấy các chủng nấm men đã phân lập được lên đĩa petri chứa mơi trường phân lập (yeast extract, peptone, D-glucose, tetracyline, agar).
Ủ các đĩa Petri ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi nhận hình dạng và kích thước khuẩn lạc các chủng nấm men.
Làm tiêu bản các chủng nấm men quan sát dưới kính hiển vi để xác định hình dạng của tế bào và sử dụng trắc vi thị kính để đo kích thước tế bào nấm men.
- Quan sát hình thái nấm men: xác định đặc điểm hình thái: hình dạng, kích thước tế bào (µm).
- Quan sát hình thái của nấm men dưới kính hiển vi quang học ở vật kính X100: chọn phiến kính trong, sạch, khi dùng lau bằng vải mềm hoặc bơng gịn cĩ thấm cồn và hơ trên ngọn lửa đền cồn. Nhỏ 1 giọt nước cất đã khử trùng lên phiến kính, dùng que cấy lấy vi sinh vật đã thuần dàn đều trong giọt nước vơ trùng trên phiến kính, cố định tiêu bản bằng phiến kính mỏng, quan sát dưới kính hiển vi và chụp ảnh, ghi lại hình thái và kích thước tế bào (µm).
- Đo kích thước và chụp hình khuẩn lạc trên mơi trường nuơi cấy.
- Đo kích thước và chụp ảnh hình dạng nấm men bằng kính hiển vi quang học.
b. Khảo sát đặc tính sinh lý và sinh hĩa
Xác định hoạt tính phân giải urea (hay hoạt tính urease): chuẩn bị mơi trường Christensen urea broth (g/L: yeast extract 0,1; potassium di-hydrogen phosphate 9,1; di-sodium hydrogen phosphate 9,5; urea 20 và phenol red 0,01; pH 6,8 ± 0,2) và khử trùng ở 115°C trong 1 giờ. Sau đĩ, chủng nấm men vào và ủ ở 30°C trong 48 giờ. Kết quả dương tính khi mơi trường chuyển sang màu hồng.
Xác định khả năng lên men 3 loại đường glucose, saccharose và mantose của nấm men: Sử dụng chai Durham (cấu tạo gồm: chai thủy tinh cĩ nắp đậy và ống thủy tinh úp ngược) để khảo sát khả năng lên men. Cho 9 mL dung dịch đường glucose vào chai Durham, tiếp tục cho vào 1mL dung dịch các chủng nấm men (với mật số 106 tế bào/mL), vặn chặt nắp chai và lắc ngang cho nấm men phân tán đều. Đặt chai đứng sao cho khơng khí khơng cịn trong ống thủy tinh úp ngược, ủ ở nhiệt độ phịng. Ghi nhận chiều cao cột khí sinh ra trong ống thủy tinh trong 24 giờ. Làm tương tự như trên với đường saccharose và maltose.
3.2.3. Thử nghiệm khả năng chịu nhiệt của các chủng nấm men
Mục đích: tuyển chọn những chủng nấm men cĩ khả năng sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ cao.
Phương pháp tiến hành
Thí nghiệm 2 nhân tố (chủng nấm và nhiệt độ) với 3 lần lặp lại.
Cấy ria các chủng nấm men trên đĩa petri cĩ chứa mơi trường nuơi cấy Ủ các đĩa petri ở các nhiệt độ khác nhau: 35, 37, 40, 43, 45o
C trong 48 giờ. Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các chủng nấm men khác nhau trên thạch. Chỉ cĩ các chủng nấm men chịu nhiệt mới cĩ khả năng phát triển thành khuẩn lạc ở nhiệt độ cao.
Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt thành các khuẩn lạc to của các chủng nấm men ở điều kiện nhiệt độ cao trong thời gian 48 giờ.
Tuyển chọn những chủng nấm men cĩ khả năng phát triển ở nhiệt độ cao cho các thí nghiệm sau.
3.2.4. Thử nghiệm khả năng chịu ethanol của các chủng nấm men
Mục đích: tuyển chọn những chủng nấm men phát triển tốt trong mơi trường cĩ ethanol.
Phương pháp tiến hành
Thí nghiệm 2 nhân tố (chủng nấm men và nồng độ ethanol) với 3 lần lặp.
Cấy ria các chủng nấm men trên đĩa petri cĩ chứa mơi trường nuơi cấy cĩ bổ sung ethanol tinh khiết ở các nồng độ khác nhau 3, 6, 9 và 12% v/v.
Ủ các đĩa petri ở nhiệt độ 30o
C trong 48 giờ.
Quan sát sự tạo thành khuẩn lạc của các chủng nấm men khác nhau trên thạch. Chỉ cĩ các chủng nấm men chịu ethanol mới cĩ khả năng phát triển thành khuẩn lạc trên mơi trường cĩ nồng độ ethanol cao.
Chỉ tiêu đánh giá: khả năng phát triển tốt thành khuẩn lạc to của các chủng nấm men ở điều kiện nồng độ ethanol cao trong thời gian từ 48 giờ.
3.2.5. Sơ tuyển nấm men cĩ hoạt tính lên men tốt
Mục đích: Khảo sát lượng CO2 sinh ra trong quá trình lên men để xác định tốc độ lên men của các chủng nấm men phân lập.
Phương pháp tiến hành
Nuơi tăng sinh các chủng nấm men được chọn. Ủ ở 30oC trong 24 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chủng 1 mL dịch tăng sinh nấm men vào chai Durham cĩ chứa 9 mL dung dịch đường glucose 2% đã được khử trùng ở 121oC trong 20 phút.
Lắc đều để dung dịch đường tràn đầy vào ống thủy tinh úp ngược nằm bên trong chai Durham.
Đo chiều cao cột khí trong ống Durham sau mỗi 2 giờ trong vịng 24 giờ lên men ở nhiệt độ 30oC để xác định khả năng lên men ethanol của các chủng nấm men.
Thí nghiệm được tiến hành với 3 lần lặp lại.
Tuyển chọn các chủng nấm men cĩ hoạt tính lên men tốt để tiến hành lên men dịch rỉ đường.
3.2.6. Khảo sát khả năng sinh ethanol ở nhiệt độ cao của các chủng nấm men đã tuyển chọn tuyển chọn
Mục đích: tuyển chọn những chủng nấm men cĩ khả năng tạo ethanol cao ở nhiệt độ cao.
Phương pháp tiến hành:
Thí nghiệm 2 nhân tố (chủng nấm men và nhiệt độ) với 3 lần lặp lại.
Nuơi cấy nấm men trong mơi trường nuơi sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt 108 tế bào /mL.
Cho 99 mL dụng dịch rỉ đường nồng độ 22o
Brix cho vào bình tam giác 250ml, thanh trùng rỉ đường bằng NaHSO3 (146 mg/L).
Chủng 1 mL dung dịch nấm men đã nuơi cấy vào bình tam giác, mật số nấm men sau khi chủng là 106 tế bào/mL
Ủ 5 ngày trong điều kiện kỵ khí, đậy bằng (water-lock) ở các nhiệt độ khác nhau: 30oC, 35oC, 37oC, 40oC và 42oC.
Đo độ Brix và pH. Chưng cất để thu ethanol và đo nồng độ ethanol thu được, quy về nồng độ ethanol ở 20°C.
Chỉ tiêu đánh giá khả năng lên men tạo ethanol ở các nhiệt độ khác nhau: nồng độ ethanol thu được sau lên men.
3.2.7. Định danh các chủng nấm men cĩ đặc tính tốt
Chủng nấm men cĩ đặc tính tốt được gửi đến cơng ty Microgene để ly trích DNA và khuếch đại vùng ITS1, ITS2 và 5.8S rDNA bằng kỹ thuật PCR. Dựa vào phần mềm BLAST để so sánh mức độ tương đồng với dữ liệu trên ngân hàng gene của NCBI (National Center for Biotechnology Information) trên trang web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ và xác định lồi của chủng nấm men.
3.2.8. Xử lý số liệu, phân tích thống kê
Số liệu được xử lý bằng chương trình Microsoft Office Excel 2010 và Statghaphics XVII.
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập nấm men
Kết quả thu được 40 chủng nấm men thuần từ 12 nguồn mẫu men cơm rượu thu thập từ chợ ở các địa điểm: huyện Châu Phú và TP Long Xuyên, tỉnh An Giang; TP Bạc Liêu, tỉnh Bạc Liêu; TP Cà Mau, tỉnh Cà Mau; quận Ninh Kiều, quận Ơ Mơn và quận Thốt Nốt, TP Cần Thơ; Huyện Lấp Vị, tỉnh Đồng Tháp; huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang; thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sĩc Trăng ; huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh; huyện Trà Ơn, tỉnh Vĩnh Long. Nguồn mẫu đa dạng nên các chủng nấm men khá đa dạng về mặt di truyền, với nhiều chủng nấm men cĩ hình dạng, kích thước khác nhau, các chủng nấm men được ký hiệu: AA1, AG5, AG1, AG1.1, AG2, AG3.3, BD1, BD2, BL1, BL2, BL3, BL4, CM2, CM2.2, CM3, CM4.4, CT1, CT2, DT1, DT2, HG1, HG2, NK2, NK4, OM1, OM2, OM3, OM4, ST1, ST2, TB1, TG1, TNN3, TNN4, TO1, TO2, TV1, TV2, TV3, TV4.
a. Huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
Ghi chú: (9a): AG1, (9b): AG1.1, (9c): AG2, (9d): AG3
[Type a quote from the document or the summary of an interesting point. You can position the text box anywhere in the document. Use the Drawing Tools tab to change the formatting of the pull quote text box.]
9c 9d
Hình 9: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Châu Phú, An Giang
b. Thành phố Long Xuyên, An Giang
Ghi chú: (10a): AA1, (10b) : AG5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
c. Thành Phố Bạc Liêu, tỉnh Bạc Liêu
Ghi chú: (11a): BL1, (11b): BL2, (11c): BL3, (11d): BL4
Hình 10: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Thành phố Long Xuyên, An Giang
10a 10b
Hình 11: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Thành phố Bạc Liêu
11c 11d
d. Thành phố Cà Mau, tỉnh Cà Mau
Ghi chú :(12a): CM2.2, (12b): CM2, (12c): CM3, (12d): CM4.4
e. Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ
13a 13b
Hình 13: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ
Ghi chú: (13a): NK2, (13b): NK4
12c 12d
Hình 12: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Phường 2, TP Cà Mau
f. Quận Ơ Mơn, Thành phố Cần Thơ
14a 14b
14c 14d
Hình 14: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Ơ Mơn, Thành phố Cần Thơ
g. Quận Thốt Nốt, Thành phố Cần Thơ
15a 15b
15c 15d
Hình 15: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Thốt Nốt, Thành phố Cần Thơ
Ghi chú: (15a) TNN3, (15b): TNN4, (15c): CT1, (15d): CT2
h. Huyện Lấp Vị, tỉnh Đồng Tháp
16a 16b
Hình 16: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Lấp Vị, Đồng Tháp
i. Huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
17a 17b
17c 17d
Hình 17: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Phụng Hiệp, Hậu Giang
j. Thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sĩc Trăng
18a 18b
18c 18d
Hình 18: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Vĩnh Châu, Sĩc Trăng
Ghi chú: (18a): ST1, (18b): ST2, (18c): BD1, (18d): BD2
k. Huyện Trà Ơn, tỉnh Vĩnh Long
19a 19b
Hình 19: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Trà Ơn, Vĩnh Long
l. Huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh
20a 20b
20c 20d
Hình 20: Các chủng nấm men phân lập từ men ở Trà Cú, Trà Vinh
Ghi chú: (20a): TV1, (20b): TV2, (20c): TV3, (20d): TV4
4.2. Đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hĩa của nấm men
Theo Nguyễn Lân Dũng (1998) và Nguyễn Đức Lượng et al. (2004) cĩ thể định danh sơ bộ các chủng nấm men dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý của nấm men. Đặc điểm hình thái gồm: mơ tả hình thái tế bào nấm men khi nuơi cấy trên mơi trường PGA 2 ngày, sự hình thành tế bào nảy chồi và kiểu nảy chồi khi nuơi cấy trên mơi trường dịch thể peptone – cao nấm men – glucose sau thời gian 2 đến 3 ngày ủ. Đặc điểm sinh lý gồm: khả năng lên men đường và khả năng đồng hĩa urea (hoạt tính enzyme urease) của nấm men.
a. Đặc điểm hình thái nấm men
Hình thái chung của các chủng nấm men gồm các dạng sau:
40 chủng nấm phân lập được đa dạng về hình dạng, kích thước. Các khuẩn lạc nấm men cĩ dạng lồi, đường kính khoảng 1-3 mm và độ dày 0,1 mm. Bề mặt một số
khuẩn lạc trơn bĩng hoặc sần. Các khuẩn lạc cĩ dạng bìa chủ yếu là dạng bìa nguyên, cĩ sợi, tỏa tia hoặc chia thùy. Về màu sắc, hầu hết các khuẩn lạc đều cĩ màu trắng sữa hoặc trắng đục. Hình dạng của một số khuẩn lạc điển hình của các chủng nấm men được thể hiện trong Hình 21.
21a 21b
21c 21d
Hình 21:Hình dạng một số khuẩn lạc điển hình
Ghi chú: (21a): HG2, (21b): CT2, (21c): BL4, (21d): TNN4
Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của tế bào nấm men dưới kính hiển vi cho thấy hình dạng các tế bào rất đa dạng, chủ yếu gồm: hình cầu, ovan và hình ellipse. Kích thước của các tế bào nấm men dao động từ 5-15 µm và chiều rộng nằm trong khoảng 2-10 µm. Dựa vào đặc điểm hình thái của các tế bào nấm men, cĩ thể chia 40 chủng nấm men đã phân lập được thành 5 nhĩm chính. Các nhĩm và tên chủng được thể hiện trong Bảng 1.
Bảng 1: Các dạng nấm men đã phân lập Tên
nhĩm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình dạng tế
bào nấm men Tên các chủng
Số lượng chủng
Nhĩm 1 Cầu lớn AA1, BD1, CM2.2, DT1, ST2, TB1,
TG1, TNN3 8
Nhĩm 2 Ovan lớn DT2, CT1, HG2, ST1, TO1 5
Nhĩm 3 Ovan nhỏ AG1, BD2, BL4, CM3, TO2, OM1 6
Nhĩm 4 Ellipse lớn AG5, AG1.1, AG3.3, OM3, CT2, HG1,
AG2, TV1, TV4 9
Nhĩm 5 Ellipse nhỏ BL1, BL2,BL3, CM2, CM4.4, OM2,
OM4, TV2, TV3, NK2, NK4, TNN4 12
Tổng số 40
Hình dạng chủ yếu của các nhĩm tế bào được thể hiện trong Hình 22
Hình 22: Hình dạng điển hình của 5 nhĩm nấm men ở vật kính X100 Nhĩm 3: Ovan nhỏ
Nhĩm 4: Ellipse lớn Nhĩm 5: Ellipse nhỏ
Đặc điểm cụ thể về hình thái của từng chủng nấm men được liệt kê một cách chi tiết trong Bảng 2.
Bảng 2: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men đã phân lập
Stt Tên
mẫu
Mơ tả khuẩn lạc Đặc điểm tế bào
Đường kính (mm) Độ dày (mm) Lồi/lõm Bề mặt, dạng bìa Màu sắc Kích thước (µm) Hình dạng
1 AA1 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x10 Cầu lớn
2 AG5 2-2,5 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x5 Ellipse
lớn
3 AG1 2-2,3 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 6x5 Ovan
nhỏ
4 AG1.1 2-2,4 0,1 Lồi Trơn, bìa nguyên Trắng 10x5 Ellipse
lớn
5 AG2 1-1,5 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên Trắng 10x5 Ellipse
lớn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6 AG3.3 2-2,2 0,1 Lồi Sần, bìa nguyên
tỏa tia Trắng 10x5