Đã sử dụng các dung môi chiết khác nhau để chiết kháng sinh. Tiến hành chiết ở các pH 3, 5, 7, 9, 11. Đánh giá hoạt tính kháng sinh ở pha dung môi hữu cơ ( dmhc ), pha dịch lọc ( N ). Kết quả thể hiện ở bảng lOa, lOb.
Bảng 10a:Hoạt tính kháng sinh sau khi chiết bằng dung môi hữu cơ đối vói E.Coli
PH
Đuừng kính vòng vô khuẩn (mm)
Chloroform Butyl acetat n-Butanol
dmhc N dmhc N dmhc N 3 16,35 8,37 0,00 14,64 0,00 8,48 5 0,00 9,99 0,00 7,88 0,00 7,30 7 19,81 0,00 0,00 15,72 0,00 10,15 9 0,00 14,56 0,00 11,22 0,00 8,51 11 0,00 13,78 0,00 8,84 0,00 6,80
Bảng lOb: Hoạt tính kháng sinh sau khi chiết bằng dung môi hữu cơ đối với B.subtilỉs
PH
Đu'ờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Chloroform Butyl acetat n-Butanol
dmhc N dmhc N dmhc N 3 16,12 6,33 0,00 10,42 0,00 8,88 5 0,00 9,02 0,00 8,75 0,00 7,02 7 22,17 0,00 0,00 16,38 0,00 16,26 9 0,00 17,82 0,00 11,34 0,00 10,58 11 0,00 15,92 0,00 9,86 0,00 8,98
Rhận xét:
Từ bảng 10a, lOb ta thấy:
+ Butylacetat, n-Butanol không chiết được kháng sinh từ dịch lọc ở tất cả các pH. + Chloroform là dung môi có khả năng chiết được kháng sinh tốt và hoàn toàn khi chiết một lần ở pH = 7.
+ Chloroform là dung môi được sử dụng cho các nghiên cứu chiết tách trong phòng thí nghiệm.
2.2.9 Kết quả phân loại theo ISP
Chủng Streptomyces 19.2.11 được nuôi cấy trên các môi trường ISP. Kết quả được giới thiệu ở bảng 11.
Bảngll: Kết quả phân loại Streptomyces 19.2.11
Các đặc điểm phân loại Streptomyces 19.2.11 Streptomyces. sp
Màu khuẩn ty khí sinh Gy
Sắc tố melanin 0
Màu khuẩn ty cơ chất 1
Sắc tố hoà tan 0 Chuỗi bào tử s Bề măt bào tử wa Arabinose + Xylose + Inositol + Manitol + Fructose + Rhamnose + Saccarose + Raffinose + Glucose + Rhận xét:
Qua quá trình tra cứu khoá phân loại theo ISP chúng tôi không tìm được loài Streptomyces có đầy đủ tất cả các đặc điểm như chủng Streptomyces 19.2.11 có thể là một loài mới trong chi Streptomyces mới được tìm thấy.
2.2.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng :
Dịch chiết kháng sinh bằng dung môi Chloroform được sử dụng để chấm sắc ký. Với 25 hệ dung môi, đã chọn được 3 hệ dung môi độc lập tách tốt. Kết quả được giới thiệu ở bảng 12.
Bảngl2.Kết quả sắc ký lớp mỏng Hệ dung môi Rf uv vsv Hê 1 0,73 0,73 Hê 2 0,61 0,61 Hê3 0,68 0,68
+ Hệl: n-butyl acetat : methanol: aceton (8:1:1) + Hệ2: Chloroform : ethanol : nước ( 6 : 3 : 1 ) + Hệ3: Ethyl acetat: n-butanol: a.acetic ( 5 : 3 : 1 )
Rhận xét:
Kết quả sắc ký khi soi bằng đèn tử ngoại u v và bằng phương pháp vi sinh vật cho phép ta kết luận trong dịch chiết có 1 thành phần kháng sinh.
2.2.11. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trong sinh khối:
Sinh khối sau khi đã sấy khô, nghiền lg sinh khối ngâm trong 5ml Chloroform. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Kết quả cho thấy dịch chiết kháng sinh từ sinh khối không có hoạt tính. Như vậy sơ bộ kết luận chủng Streptomyces 19.2.11 có khả năng sinh tổng
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT
3.1. KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu từ kết quả thực nghiệm chúng tôi đã hoàn thành được các mục tiêu đề ra và có các kết luận sau:
> Sau khi cải tạo giống bằng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên và đột biến nhân lạo đã chọn được biến chủng có hoạt tính kháng sinh tăng rõ lệt, hiệu xuất sinh tổng hợp kháng sinh tăng mạnh.
r Đã chọn được môi trường MT2 là môi trường lên men tối thích.
r Dung môi Chloroform có khả năng chiết kháng sinh tốt ở pH=7.
> Đã xác định được đặc điểm hình thái và sinh lý của chủng Streptomyces
19.2.11.
> Đã chọn được ba hệ dung môi độc lập chạy sắc ký tốt. Kết quả cho một
vết kháng sinh duy nhất khi phát hiện bằng ánh sáng uv trùng với vết khány; sinh khi hiện hình bằng v s v . Kết luận kháng sinh do Streptomyces 19.2.11
là đơn thành phần.
3.2 ĐỂ XUẤT
r Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định của kháng sinh trong dung mồi Chloroform.
r Nghiên cứu điều kiện tối ưu hoá lên men kháng sinh từ chủng
Streptomyces 19.2.11.
r Nghiên cứu quá trình chiết tách, tinh chế và xác định cấu trúc hoá học của kháng sinh này.
Hình 3. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh sau khi đột biến bằng ánh sáng u v
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình v s v học công nghiệp, NXB khoa học và kỹ thuật.
[2]. Bộ y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, NXB Y học.
[3]. Nguyễn Lân Dũng (1975), Vi sinh vật học, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp.
[4]. Kiều Khắc Đôn (chủ biên) (1999), Vi sinh vật học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
[5]. Đỗ Thu Hà (2002), "Định loại chủng xạ khuẩn Streptomyces ĐN-05 sinh chất kháng sinh có hoạt phổ rộng được phân lập từ đất tỉnh Quảng Nam", Tạp chí sinh học, tập 24, số 1, trang 59-63.
[6]. Phạm Gia Huệ,Trần Tử An (1998), Hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội.
[7]. Từ Minh Koóng (chủ biên) (2001), Kỹ thuật sản xuất dược phẩml,
Trường Đại học Dược Hà Nội.
[8]. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ v s v , NXB nông nghiệp.
[9]. Hồ Viết Quý ( 2000), Chiết tách, phân chia, xác định các chất bằng
dung môi hữu cơ, tập 1, NXB khoa học và kỹ thuật.
[10]. Trần Thị Thanh (2001), Công nghệ vi sinh, NXB khoa học và kỹ
thuật.
[12]. André A. Neves, Luis M. Vieira and José' C.Menezes (2001), "Effect of Preculture Variability on Clavulanic Acid Fermentation",Biotechnology and Bioengineering, Vol.72, No.6, P.628- 632.
[13]. Chang Joon Kim, Yong Keun Chang, Gie-Taek Chun, Yeon Ho Jeong and Sang Jong Lee (2001), "Continuous Culture of Immobilized Streptomyces Cell for Kasugamycin Production", Biotechnology Progress, Vol.l7,No.3, P.453-461.
[14]. E. B Shirling & D. Gottlieb (1966), "Methods for characterozation of Streptomyces Species", IntJ.Syst.Bacteriol, Vol.16, No.3, P.313-340. [15]. E. B Shirling & D. Gottlieb (1968), "Cooperative description of type
culture of Streptomyces", IntJ.Syst.Bateriol, Vol.18, No.2, P.69-189. [16]. Johanes A. Roubos, Preben Kraben, Wim, T.A.M. Delaat, Robert
Babuska and Joseph J.Heijnen (2002). "Clavulanic Acid Degradation in Streptomyces clavuligerus Fed-Batch Cultivations", Biotechnology Pregress, Vol. 18, No.3, P.451-457.