❖ Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán : > Nguyên tắc :
Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy v s v kiểm định, kháng sinh từ mẫu thử khuyếch tán vào môi trường sẽ ức chế sự phát triển của v s v kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
'r Tiến hành:
+ Chuẩn bị môi trường cấy v s v kiểm định:
v s v kiểm định được cấy vào môi trường canh thang (đối với VK) nhũ dịch v s v kiểm định có nồng độ 106-107 tế bào /ml, đưa nhũ dịch vào môi trường thạch thường 45°c. Lắc đều đổ vào đĩa Petri với thể tích 20 ml/đĩa.
+ Đưa mẫu thử vào đĩa Petri có chứa môi trường v s v kiểm định. Có 3 cách đưa mẫu thử vào môi trường chứa v s v kiểm định:
s Đặt khối thạch: Đặt khối thạch có chứa v s v sinh kháng sinh lên bề mặt môi trường v s v kiểm định.
s Tạo giếng thạch: Tạo các giếng trên môi trường v s v kiểm định (0=6,Omm), sau đó nhỏ mẫu thử vào (0,05ml/giếng).
s Đặt khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc(0=6,Omm) đã được tẩm ba lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở t°c ^ 50°c, sau đó
đặt lên bề mặt môi trường v s v kiểm định.
+ Nuôi cấy: Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37°c trong 18-24h.
+ Đánh giá kết quả:Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và đánh giá theo công thức:
n 2
Ẹ Di Ẻ (D i-D )
D = — --- s = 1 j= !---
n ! n - 1
D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn,
Di : Đường kính vòng vô khuẩn ở thử nghiệm thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
n: Sô thí nghiệm làm song song.
♦♦♦ Phương pháp chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên:
+ Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 19.2.11 cho vào ống nghiệm chứa lOml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng lO^định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10'6 bằng nước cất vô trùng.
+ Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,lml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10'4 đếh 10'6 nhỏ lên bề mặt thạch của MT3 trong đĩa Petri. Dùng que vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch.Tiến hành trên 3 đĩa Petri cho mỗi nồng độ pha loãng,cho các đĩa vào tủ ấm 30°c trong 6 ngày cho các khuẩn lạc phát triển.
+ Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển tốt, mọc riêng rẽ sau 6 ngày, cấy Zigzac lên bề mặt MT3 trong đĩa Petri cho vào ủ ở 30°c trong 6 ngày rồi lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đặt khối thạch.
♦♦♦ Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV:
+ Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 19.2.11 cho vào 10 ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng lO ^định ước). Sau đó dùng lml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10'6 làm mẫu chứng 9ml còn lại được đưa vào điã Petri vô trùng.
+ Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng u v : Đĩa Petri chứa 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ lO^định ước) được chiếu dưới ánh sáng u v ở khoảng cách 60cm trong thời gian 5 phút, sau đó để chỗ tối 2-3 h, dùng pipet vô trùng hút và pha loãng hỗn dịch này đến nồng độ 10'5.
+ Cấy các bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1 ml mẫu chứng nồng độ 10’6 và 0,1 ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở nồng độ 10"4,10~5 cho vào đĩa Petri chứa MT3, sau đó dùng trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa, các đĩa Petri sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 30°c trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc,xác định % độ sống sót theo công thức:
%Sống sót = X100%
Nm :SỐ khuẩn lạc trong thí nghiêm sau đột biến,
No : Số khuẩn lạc trong mẫu chứng.
Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên.
Làm song song mẫu chứng.
% biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức :
% biến đổi hoạt tính = X100%
Do
Di: Đường kính vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến,
Do: Đường kính vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được lựa chọn các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
♦♦♦ Phương pháp lên men gián đoạn :
+ Tạo giống cấp I: chủng giống Streptomyces 19.2.11 sau khi nuôi cấy
trên thạch nghiêng MT3 đủ 6 ngay tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa lOOml MT3dd bằng lOml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn
ở nhiệt độ 30 ± 0,1 °c, tốc độ quay 178- 180 vòng/phút trong 48h.
+ Lên men: Sau 48h nhân giống tiến hành lên men trên nhiều môi trường khác nhau để trọn môi trường lên men tốt nhất, giống Cj được cấy vô trùng vào bình nón 500ml chứa các môi trường MT2dd, MT3dd, MT4dd với tỷ lệ Vgiống: V môi trường = 1:10, các bình lên men lắc ở t°c = 30 ± 0,1°C với tốc độ quay 178- 180vòng/phút trong 120h.
❖ Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ :
Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH thích hợp rồi chiết với từng dung môi chiết.
+ Phương pháp chiết một lần : Dịch lỏng, dung môi được cho lần lượt vào bình gạn theo tỷ lệ V dung môi :Vdịch lọc =1:5, lắc lphút để phân lớp lh. Sau đó tách riêng dung môi và dịch lọc.
+ Phương pháp chiết nhiều lần : Dịch lọc, dung môi cho lần lượt vào bình gạn theo tỷ lệVdung môi :Vdịch lọc= 1:15 lắc 1 phút, để phân lớp trong lh, tách riêng dung môi và dịch lọc. Làm tiếp 2 lần với tỷ lệ dung môi trên.
+ Hoạt tính kháng sinh của dung môi và dịch lọc sau mỗi lần chiết được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
❖ Phương pháp xác định kháng sinh nội bào :
Rửa sinh khối với nước cất, sấy ở t°c : 40-50°C đến khô (48h) sau đó nghiền với dung môi đã lựa chọn để chiết kháng sinh nội bào, thứ tự hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc.
❖ Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trong dịch lên men. Dịch lên men được phân đều vào 5 ống nghiêm sau đó chỉnh pH khác nhau : 3,5,7,9,11, để vào tủ lạnh. Sau 3 ngày, chỉnh lại pH các ống nghiệm về trung tính. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch. Tiếp tục thử như trên sau 5 ngày.
❖ Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng :
Bản mỏng sắc ký có kích thước thích hợp, được hoạt hoá ở 110°c trong vòng 30 phút, dung môi được pha theo tỷ lệ cho vào bình sắc ký (chiều dày lớp dung môi không quá lcm), chấm dịch chiết có chứa hoạt chất cần sắc ký lên bản mỏng cách mép dưới l,5cm. Sấy khô bản mỏng ở 40-50°C, cho bản mỏng sắc ký đã chấm dịch chiết vào bình sắc ký, khi dung môi chạy đến 3/4 bản mỏng bỏ ra đánh dấu vết dung môi chạy (dm), xác định vết bằng phương pháp sau:
+ Soi đèn tử ngoại : Bản mỏng sắc ký tráng sắn đã được trộn với một chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, khi soi dưới ánh sáng tử ngoại, nếu có vết thử sẽ cho mầu thẫm dưới đèn tử ngoại.
+ Phương pháp hiện hình vi sinh vật: Đặt bản mỏng vào đĩa petri vô trùng đổ môi trường thạch thường đã tiệt trùng có chứa v s v kiểm định, ủ ở 37°c trong 24h. Vết kháng sinh được xác định bằng sự xuất hiện vòng vô khuẩn.
Tính Rf:
Rf —
Dm
Dv : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết Dm : Khoảng cách dung môi chạy
♦♦♦ Phương pháp phân loại Streptomyces 19.2.11 theo ISP
+ Chuẩn bị giống : Giống Streptomycesl9.2.1l được nuôi cấy trong ống nghiêng đủ 6- 14 ngày tuổi.
+ Xác định đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và đánh giá khả năng tạo thành sắc tố hoà tan:
- Các môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 được hấp tiệt trùng ở
118°- 120°c/30phút, dùng pipet vô trùng hút 20ml vào đĩa petri vô trùng, mỗi môi trường cấy làm 4 đĩa, cấy bào tử lên bề mặt thạch, ủ ở 28-30°C. Tiến hành quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất sau 7, 14, 21 ngày-
- Dùng kính hiển vi điện tử để quan sát chuỗi bào tử và bề mặt bào tử, tiến hành chụp ảnh.
- Sắc tố hoà tan nằm ngay trong môi trương có các màu: Vàng, xanh, đỏ, tím... Nếu có ký hiệu là 1, ngược lại kỷ hiệu là 0.
- Xác định sắc tố melanin: Nuôi cấy xạ khuẩn trên các môi trường ISP6, ISP7 đã hấp tiệt trùng, quan sát ở ngày thứ 2 ,thứ 4, Nếu có ký hiệu là 1, ngược lại ký hiệu là 0.
- Khả năng tiêu thụ nguồn carbon: Nuôi cấy xạ khuẩn trong các môi trường chứa các nguồn carbonhydrat khác nhau ( ISP9) đánh giá ở ngày thứ
10-16. Nếu xạ khuẩn phát triển đánh dấu (+), nếu không đánh dấu (-), nếu không rõ ràng đánh dấu (±), nếu phát triển rất mạnh so với glucose đánh dấu (++).