1.4.5.1. Theo Y học cổ truyền và kinh nghiệm dân gian
- Hoàng liên ô rô vị đắng tính mát, vào phế, vị, can, thận, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, tiêu viêm, làm se [14].
- Rễ hoặc thân 4 – 15g (thuốc sắc hoặc thuốc bột) chữa kiết lỵ, ăn không tiêu, tiêu chảy, viêm ruột, viêm gan, vàng da, đau mắt [12,14], quả có tác dụng lợi tiểu [8]. Dùng ngoài, dược liệu nấu nước đặc rửa chữa viêm da, dị ứng, ngứa lở [14].
- Hoàng liên ô rô còn được dùng chữa ho lao, sốt cơn, khạc máu, lưng gối yếu mỏi, chóng mặt, ù tai, mất ngủ [6].
1.4.5.2. Tác dụng của Berberin và palmatin
- Berberin có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn : Streptococcus
hemolyticus, Vitro cholerae, Staphylococcus aureus, Streptococcus
virideus, Shigella dysenteriae, Bacillus subtilis, Bacillus pneumoniae,
Bacillus proteus, Bacillus typhi, Bacillus coli [1].
- Berberin với liều thấp làm tim hưng phấn, giãn động mạch, hạ huyết áp, làm tăng mật, hạ sốt [1].
- Berberin đem khử hóa cho tetrahydroberberin có tác dụng an thần, làm mềm cơ, hạ huyết áp nhẹ [1].
- Palmatin có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), liên cầu khuẩn (Streptococcus), còn đối với các loại vi khuẩn khác (lỵ, thương hàn,…) không thấy có kết quả rõ rệt. Tác dụng ức chế vi khuẩn của palmatine kém các loại kháng sinh thông thường [1].
- Palmatin được dùng để điều chế dI – tetrahydropalmatin có tác dụng an thần [1].
21
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Thân phơi khô của cây Hoàng liên ô rô thu hái vào tháng 9 năm 2015 ở Bắc Kạn. Mẫu nghiên cứu được giám định thực vật học bởi Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu
Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu: Mẫu thân cây Hoàng liên ô rô được rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50o
C, thái nhỏ. Dược liệu (1 kg) sẽ được chiết xuất bằng ethanol 96% (3L × 3 lần) bằng phương pháp siêu âm. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cao ethanol. Hòa cao ethanol với khoảng 300 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, ethyl acetat và n-buthanol (mỗi dung môi 3 lần mỗi lần 300 mL).
2.1.3 Hóa chất, thiết bị 2.1.3.1.Hóa chất 2.1.3.1.Hóa chất
- Hóa chất: Enzym acetylcholinsterase loại EC 3.1.1.7 (Sigma, Singapore), Acetylthiocholine iodide (ACTI) (Sigma, Singapore); 5,5‟-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) (Sigma, Singapore), Tris HCl và berberin clorid chuẩn (Himedia, Ấn Độ).
- Dung môi: n – hexan, ethylacetat (EtOAc), n – buthanol (n-BuOH), methanol (Shouguang, Trung Quốc).
2.1.3.2. Thiết bị
- Cân phân tích AY 129 (Shimadzu, Nhật Bản)
- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal - Máy đo quang UV Aligent technologies Cary 60 UV-Vis, Mỹ - Máy cô quay chân không Rovapor R- 210 (Buchi- Đức)
- Pipet, bình định mức, cối xứ, giấy lọc (đường kính 11 cm), phễu lọc - Đầu côn các loại
- Cuvet 1 mL
22
2.2. Nội dung nghiên cứu
Để thực hiện các mục tiêu đề ra, đề tài được thiết kế với các nội dung sau:
Thực hiện mục tiêu 1: Xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng ức
chế enzym AChE.
- Khảo sát mức độ ảnh hưởng của nồng độ của dung dịch cơ chất ATCI đến phương pháp thử.
- Khảo sát mức độ ảnh hưởng của nồng độ của dung dịch thuốc thử DTNB đến phương pháp thử.
- Khảo sát mức độ ảnh hưởng của hoạt độ enzym AChE đến phương pháp thử.
- Khảo sát mức độ ảnh hưởng của thời gian để phản ứng diễn ra đến phương pháp thử.
Thực hiện mục tiêu 2: Đánh giá được tác dụng ức chế enzym
acetylcholinsterase in vitro của Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)
- Chiết xuất cao từ dược liệu: Mẫu thân cây Hoàng liên ô rô được rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50oC, thái nhỏ. Dược liệu (1 kg) sẽ được chiết xuất bằng ethanol 96% (3L × 3 lần) bằng phương pháp siêu âm. Dịch chiết được lọc qua giấy lọc và gộp lại, cô dịch chiết bằng máy cô quay chân không thu được cặn ethanol. Hòa cặn với khoảng 300 mL nước cất rồi chiết phân đoạn lần lượt với n-hexan, ethyl acetat và n-butanol (mỗi dung môi 3 lần mỗi lần 300 mL).
- Đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE theo phương pháp đã xây dựng ở mục tiêu 1.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE
Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE được xây dựng và sử dụng trong nghiên cứu lần đầu tiên bởi tác giả Ellman vào năm 1961[39]. Nguyên tắc của phương pháp như sau:
23
Cơ chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân nhờ xúc tác của AChE tạo thiocholin. Sản phẩm thiocholin phản ứng với thuốc thử acid 5-5‟- dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) tạo thành hợp chất acid 5-thio-2-nitro benzoic có màu vàng. Lượng hợp chất màu được tạo thành này tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Dựa vào xác định độ hấp thụ (cường độ màu) của mẫu thử ở 412 nm để đánh giá hoạt tính của AChE.
Hình 2.1. Sơ đồ phản ứng tạo màu với thuốc thử Elman [39]
Mặc dù hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzym AChE in vitro cùng hướng được thực hiện, nhưng đa số các nghiên cứu này đều sử dụng phương pháp đo quang của Ellman kết hợp với một số điều chỉnh trong điều kiện thực nghiệm. Điều kiện của phương pháp tiến hành thường có sự thay đổi giữa các nghiên cứu về: nồng độ dung dịch cơ chất ATCI (1-75 mM) [35,50,59]; nồng độ dung dịch thuốc thử DTNB (1,5-10 mM) [35,49,50,59]; hoạt độ của enzym AChE (0,2-5,0 IU/mL) [20,35,59]; thời gian ủ trước phản ứng: khoảng 5-15 phút [49,55]; thời gian để phản ứng được xúc tác bởi enzym diễn ra: khoảng 5-30 phút [55], khoảng thời gian này phụ thuộc vào tốc độ phản ứng, nồng độ cơ chất và hoạt độ enzym.
24
Trong các phương pháp đo quang thường chọn bước sóng hấp thụ cực đại của sản phẩm để đo độ hấp thụ quang, từ đó định lượng sản phẩm. Tuy nhiên, do mỗi loại máy đo quang thường chỉ có một số loại kính lọc sắc đi kèm nên trong các nghiên cứu chỉ có thể chọn bước sóng nào gần với bước sóng hấp thụ cực đại nhất để đo. Các nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro thường sử dụng một trong 3 bước sóng là 405, 412 và 420 nm để định lượng [20,55].
Những thay đổi về điều kiện phản ứng enzym được đề cập ở trên có thể do nhiều nguyên nhân khác nhau: xuất phát từ điều kiện thực tế phòng thí nghiệm (sự sẵn có về máy móc và hóa chất); sự khác nhau về tỷ lệ phối hợp giữa các thành phần trong hỗn hợp phản ứng enzym; đặc tính của mẫu nghiên cứu: các mẫu khác nhau có khả năng hòa tan trong các dung môi khác nhau. Ngoài ra, enzym và cơ chất khá nhạy cảm bởi tác động của yếu tố khách quan. Điều này tạo ra sự khác nhau về hoạt tính của enzym và mức độ cơ chất bị thủy phân không bởi xúc tác enzym giữa các nghiên cứu.
Do vậy, hiện nay vẫn chưa có một điều kiện tối ưu và quy trình chuẩn nào của phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman được áp dụng chung cho tất cả những nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in
vitro. Do đó, việc khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp thử để
lựa chọn được điều kiện thử nghiệm phù hợp với thực tế là rất cần thiết. Trong đề tài khóa luận này, những yếu tố được lựa chọn để khảo sát mức độ ảnh hưởng đến phương pháp thử gồm: nồng độ của dung dịch cơ chất ATCI; nồng độ của dung dịch thuốc thử DTNB; hoạt độ của enzym AChE; thời gian để phản ứng diễn ra. Đây cũng là những yếu tố thường có sự thay đổi khá nhiều giữa các nghiên cứu trong và ngoài nước.
Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro Quy trình của thử nghiệm bước đầu được tiến hành như sau:
Thêm lần lượt từng dung dịch gồm: dung dịch đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0), dung môi hoặc mẫu thử và dung dịch enzym AChE có hoạt độ thích hợp vào cuvette 1 mL. Hỗn hợp các dung dịch này được trộn đều và ủ ở 25oC trong 15 phút.
25
Sau đó, dung dịch thuốc thử DTNB và dung dịch cơ chất ATCI lần lượt được thêm vào hỗn hợp và trộn đều. Tiếp tục ủ hỗn hợp trong một khoảng thời gian nhất định ở 25oC, sau đó, dung dịch được đo độ hấp thụ ở bước sóng 412 nm. Mỗi thử nghiệm được làm lặp lại 3 lần. Chất chuẩn dương sử dụng là Berberin clorid [55].
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp thử
+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử:
Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử, hai dung dịch này được khảo sát ở 3 mức nồng độ khác nhau lần lượt là 1,25; 2,5 và 5 mM (cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB được phối hợp vào hỗn hợp phản ứng ở tỷ lệ số mol là 1:1).
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp phản ứng khảo sát ảnh hưởng của nồng độ
dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử
Thành phần Đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0) AChE 0,5 IU/mL DTNB (1,25; 2,5; 5 mM) ACTI (1,25; 2,5; 5 mM) Thể tích (µL) 800 100 50 50
+ Khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ AChE đến phương pháp thử nghiệm và lựa chọn thời gian phản ứng:
Để khảo sát ảnh hưởng của hoạt độ enzym đến phương pháp thử, dung dịch enzym ở 3 hoạt độ khác nhau lần lượt là 0,25; 0,5; 1,0 IU/mL được phối hợp vào hỗn hợp phản ứng với thành phần như được trình bày ở bảng 2.2. Sau đó, độ hấp thụ của mẫu thử được xác định ở 6 thời điểm khác nhau là: 3, 5, 7, 10, 15, 20 phút sau khi phản ứng xúc tác bởi enzym bắt đầu xảy ra.
26
Bảng 2.2. Thành phần hỗn hợp phản ứng khảo sát ảnh hưởng của hoạt
độ enzym đến phương pháp thử Thành phần Đệm sodium phosphate 0,1M (pH 8,0) AChE (0,25; 0,5; 1,0 IU/mL) DTNB* ACTI* Thể tích (µL) 800 100 50 50
* Trong đó, nồng độ cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đã được xác định dựa trên kết quả khảo sát trước đó.
Phần trăm ức chế hoạt độ enzym AChE (% I) được tính theo công thức:
Trong đó: %I: phần trăm hoạt tính AChE bị ức chế
Ac: độ hấp thu của mẫu chứng (không chứa 100 µL dung dịch thử) At: độ hấp thu của mẫu thử
Ao: độ hấp thu của mẫu trắng (1 mL dung dịch đệm sodium phosphate)
2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym acetylcholinsterase in vitro của Hoàng liên ô rô (Mahonia nepalensis DC, họ Berberidaceae)
Phương pháp đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE in vitro
được tiến hành dựa trên kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp thử ở mục 2.3.1. Tác dụng ức chế AChE in vitro của mẫu thử được xác định bằng giá trị phần trăm hoạt tính enzym bị ức chế (I%) và được tính theo CT1. Mỗi mẫu thử được thực hiện lặp lại 3 lần. Giá trị ức chế enzym AChE IC50 của các mẫu thử được tính dựa vào đồ thị log (nồng độ mẫu thử) và % ức chế xây dựng trên phần mềm Sigma Plot 12.
Để có cơ sở đánh giá tác dụng ức chế AChE in vitro của mẫu nghiên cứu, berberin clorid được lựa chọn làm mẫu đối chứng dương. Hợp chất này đã được nghiên cứu và chứng minh sở hữu tác dụng ức chế AChE in vitro khá mạnh. Thực tế, berberin clorid cũng đã được sử dụng làm mẫu đối chứng dương trong một số nghiên cứu [35,50,55].
27
Động học phản ứng ức chế enzym AChE của dịch chiết cây Hoàng liên ô rô được tiến hành theo phương pháp mô tả trước đây [29], dựa trên phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE của Ellman với sự thay đổi nồng độ mẫu thử (phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô có tác dụng ức chế enzym cao nhất) và thay đổi nồng độ cơ chất ACTI. Sử dụng các đồ thị 1/[ACTI] và 1/V (1/tốc độ phản ứng) (đồ thị Lineweaver – Burk) để xác định kiểu động học ức chế enzym; đồ thị động học Dixon để xác định hằng số ức chế Ki của mẫu thử dịch chiết.
2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu thực nghiệm được tổng hợp và phân tích xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên máy vi tính dưới sự trợ giúp của phần mềm Microsoft Excel 2013, Sigma Plot 12.
Các thuật toán sử dụng:
+ Tính trung bình: ( ⃐ ), độ lệch chuẩn (SD), trong đó độ lệch chuẩn được tính theo công thức:
SD = √∑ ̅
+ Tính tỷ lệ %
Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng giá trị trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn, ký hiệu: ⃐ ± SD. So sánh giá trị trung bình giữa các mẫu thử sử dụng phép thử t-Student. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.
28
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chiết xuất và phân đoạn dịch chiết Hoàng liên ô rô
Thân cây Hoàng liên ô rô (1kg) sau khi được phơi khô, thái nhỏ và chiết với ethanol thu được (78,25g cao ethanol). Cao ethanol thu được đem chiết phân đoạn với n-hexan, ethylacetat và n-buthanol thu được 3 loại cao phân đoạn gồm: 17,45g cao n-hexan; 20,86g cao ethylacetat; 25,06g cao n- buthanol.
Các phân đoạn dịch chiết đem hòa tan trong dung môi methanol để chuẩn bị các dung dịch mẫu thử có nồng độ khác nhau và đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro của từng phân đoạn dịch chiết.
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn thân cây Hoàng liên ô rô 3.2. Xây dựng phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE
Phương pháp đo quang in vitro dùng để đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1961 bởi tác giả Ellman. Phương pháp đo quang của Ellman được nhiều tác giả trên thế giới sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE. Tuy nhiên, một số điều kiện thử nghiệm như: nồng độ cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB, hoạt độ enzym AChE, thời gian phản ứng… thường có sự khác nhau giữa các nghiên cứu, do đặc điểm và điều kiện của từng nghiên cứu. Vì vậy, hiện chưa có một
Thân cây Hoàng liên ô rô phơi khô, thái nhỏ (1kg)
Cao Ethanol (78,45g) Cao n-hexan (17,45g) Cao Ethylacetat (20,86g) Cao n-buthanol (25,06g) Chiết với Ethanol 96% (3 lần)
29
điều kiện tối ưu nào cho phương pháp thử này. Với mục tiêu xây dựng được phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Khoa, cũng như để chủ động trong quá trình tiến hành nghiên cứu, một số yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp đã được khảo sát.
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử
Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB đến phương pháp thử được khảo sát ở 3 nồng độ là 1,25; 2,5 và 5 mM. Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB
đến phương pháp thử
Mẫu Độ hấp thụ quang đo đƣợc ở nồng độ cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB khảo sát 1,25 mM 2,5 mM 5 mM 1 0,6411 0,9890 1,1155 2 0,6502 1,0344 1,0443 3 0,6255 1,0522 1,0670 Trung bình 0,6389± 0,0125 1,0252 ± 0,0326 1,0756 ± 0,0364 t-student test p1-2=<0,001; p2-3 = 0,148; p1-3= <0,001
Từ kết quả ở bảng 3.1 cho thấy khi nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB thay đổi, độ hấp thụ của mẫu thử cũng thay đổi và tăng dần theo nồng độ cơ chất và thuốc thử. Giá trị độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp phản ứng thấp nhất khi nồng độ dung dịch cơ chất ACTI và thuốc thử DTNB là 1,25 mM. Giữa hai mức nồng độ cơ chất và thuốc thử còn lại được khảo sát là 2,5 và 5 mM, chênh lệch về độ hấp thụ và độ lệch chuẩn tương đối không đáng kể, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p=0,148>0,05. Tuy nhiên, mức nồng độ cơ chất và thuốc thử là 2,5 mM được