Định tính glycosid tim
1 2 3
4 5 6
Lấy 3g dược liệu, chiết soxhlet với n-hexan 1 giờ. Bã dược liệu sấy khô, cho vào bình cầu, đun hồi lưu với ethanol 40% trong 1 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với hỗn hợp chloroform : ethanol tỷ lệ 4:1 (3 lần, mỗi lần 5ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch, loại nước bằng natri sulfat khan. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại để làm các phản ứng định tính sau:
Phản ứng Liebermann
Hòa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 1ml anhydrid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 450
, cho từ từ theo thành ống 1ml H2SO4 đặc. Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu đỏ tím thì dương tính..
Phản ứng Baljet
Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1ml ethanol 90%, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính.
Phản ứng Legal:
Hòa tan cắn trong 0,5ml ethanol 90%. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natrinitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính.
Định tính alcaloid
Lấy 2g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15 ml dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml.
Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9-10. Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natrisulfat khan. Dịch chiết đem lắc với H2SO4 1N
hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước chia đều vào ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml để làm các phản ứng sau:
Phản ứng với thuốc thử Mayer
Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
Thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính.
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff
Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendoff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính.
Chuẩn bị:
Lấy dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2cm), đun sôi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nóng được dịch lọc. Dịch lọc lại, đem cô đến cắn (cắn toàn phần).
Định tính saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt
Hòa tan một ít cắn vào khoảng 5ml nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to. Thêm nước cất đến khoảng 10ml, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát cột bọt thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính.
Định tính flavonoid
Hòa tan cắn vào ethanol 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc đem làm các phản ứng:
Phản ứng với hơi amoniac (NH3)
Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì dương tính.
Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10% nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì dương tính.
Phản ứng Cyanidin
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1ml dịch lọc, 1 ống thêm ít bột magie kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống còn lại để đối chiếu.
Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì dương tính.
Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid
Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3
5%, lắc đều nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì dương tính. Định tính coumarin
Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm các phản ứng:
Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch lọc: + Ống 1: thêm 0,5ml NaOH 10%.
+ Ống 2: để nguyên.
Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng + Ống 1: có tủa đục màu vàng.
+ Ống 2: trong suốt.
Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4ml: + Ống 1: trong suốt.
+ Ống 2: có tủa đục.
Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì dương tính. Định tính anthranoid
Phản ứng Borntraeger
Hòa tan một ít cắn vào 10ml H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10ml chloroform, gạn lấy lớp
chloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1ml, thêm 1ml NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính.
Định tính acid hữu cơ
Hòa tan cắn trong nước nóng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy có bọt khí bay lên thì dương tính.
Định tính tanin
Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2ml dịch lọc.
+ Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì dương tính.
+ Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì dương tính.
+ Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì dương tính.
Định tính đường khử
Hòa tan cắn vào 1ml nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch thuốc thử Felling B.
Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì dương tính.
Định tính acid amin
Hòa tan cắn vào 2ml nước nóng. Lọc nóng, lấy dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 5 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy 2 phút nếu thấy xuất hiện màu tím thì dương tính.
Định tính chất béo
Hòa tan cắn vào 2ml nước nóng, lọc nóng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết trên lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi, nếu để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính.
Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh lá thì dương tính.
Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm một ít cắn khô, hòa tan trong 2ml chloroform và 1ml anhydrid acetic. Để ống nghiệm nghiêng 450, thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì dương tính.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết
quả Kết luận
1 Saponin Hiện tượng tạo bọt ++ Có
2 Alcaloid
TT.Mayer -
Không TT. Dragendorff -
TT. Bouchardat -
3 Anthranoid Phản ứng Bomtraeger - Không
4 Glycosid tim Phản ứng Liebermann - Không Phản ứng legal - Baljet - Keler Kiliani - 5 Flavonoid Phản ứng cyanidin +++ Có Phản ứng với NH3 ++ NaOH 10% - Fe(CL)3 +++
7 Tanin Fe(Cl)3 5% +++ Có Gelatin 1% Pb(CH3COO)2 10% +++ Cu(CH3COO)2 +++
8 Đường khử TT.Fehling - Không
9 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không
10 Sterol H2SO4 đặc/anhydrid
acetic - Không
11 Caroten H2SO4 đặc + Có
12 Polysaccharid TT.lugol - Không
13 Acid amin TT.Ninhydrin - Không
14 Acid hữu cơ Bột Na2CO3 - Không
Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (+++) dương tính rõ
Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học sơ bộ cùng với các nghiên cứu trước đó, nhận thấy dược liệu lá Dâu tằm có chứa các nhóm hợp chất tanin, flavanoid, saponin, caroten, alcaloid, acid béo.