hợp chất có trong lá dâu tằm
2.2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất
Lá dâu được thu hái, rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50o
C, nghiền nhỏ thu được bột thô, đem ngâm chiết kỹ 4 lần bằng dung môi methanol ở nhiệt độ phòng. Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn chiết methanol.
Cắn chiết được phân bố vào nước cất vừa đủ và tiến hành chiết lần lượt với n-hexan, ethylacetat. Các dịch chiết n-hexan, ethylacetat và phần nước còn lại được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn n-hexan, cắn ethylacetat và cắn nước.
2.2.4.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất
Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây cũng như phân lập các hợp chất, các phương pháp sắc ký đã được sử dụng như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột (CC), sắc ký pha đảo.
Sắc ký lớp mỏng (TLC): được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm Kieselgel 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
Sắc ký cột (CC): được tiến hành với chất hấp phụ là silicagel pha thường và pha đảo. Silicagel pha thường có cỡ hạt là 0,040- 0,063 mm (230- 400 mesh, Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Nhật Bản), YMC ODS-A (50μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản). Silicagel pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S
(Merck, Damstadt, Đức).
Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đề cập trong các tài liệu là sự kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm: IR, MS, NMR,…
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm thực vật
3.1.1. Mô tả đặc điểm hình thái thực vật
Cây cao 2-3 m. Thân cành nhiều nhựa không gai, trên thân cành có nhiều mầm, mầm đỉnh, mầm nách. Lá mọc so le, nguyên hoặc chia ba thùy. Trên các cây già lá dài 8-15cm có hình tim ở gốc lá, nhọn ở chóp lá và có các khía răng cưa ở mép lá từ cuốn lá tỏa ra 3 gân rõ rệt. Hoa đơn tính, hoa đực mọc thành bông, có 4 lá đài, có 4 nhị, hoa cái cũng mọc thành bông, hoặc thành hình khối cầu, có 4 lá đài. Quả bé bao bọc các đài, mọng nước thành một quả phức (quả kép). Quả có màu từ trắng đến hồng, khi chín có màu tím sẫm.
a b
Hình 3.1: Một số hình ảnh về cây dâu tằm
Chú thích: a- Lá dâu; b- Quả dâu
3.1.2. Mô tả kèm hình ảnh đặc điểm vi phẫu
Vi phẫu thân
Vi phẫu thân hình tròn, có rất nhiều lông che chở. Cấu tạo từ ngoài vào trong gồm có: lớp biểu bì là một lớp tế bào ngoài cùng xếp sát nhau, đều đặn, màng ngoài có một lớp cutin bao bọc. Tiếp theo là mô mềm vỏ gồm nhiều lớp tế bào hình nhiều cạnh, có góc tròn, tại các góc có những khoảng gian bào nhỏ, mô dày cấu tạo bảo nhiều lớp tế bào thành dày lên ở các góc, xếp thành
hình vuông khép kín. Phần trụ giữa gồm có trụ bì, bó gỗ nằm ngay sát trụ bì. Vùng gỗ phát triển nhiều ở góc, xếp thành một vòng liên tục. Trong cùng là mô mềm ruột gồm nhiều tế bào đa giác, gần như tròn, các góc có khoảng gian bào nhỏ.
Hình 3.2: Đặc điểm vi phẫu thân cây Dâu tằm
Chú thích: 1-Lông; 2-Biểu bì; 3-Mô mềm vỏ; 4-Mô dày; 5-Trụ bì; 6-Gỗ; 7-Mô mềm ruột
Vi phẫu cuống lá
Cấu tạo tương tự như thân. Lông che chở bao phủ trên lớp biểu bì, tiếp theo là mô mềm vỏ, mô dày, trụ bì và trong cùng mô mềm ruột. Ngay cạnh mô mềm ruột có mô cứng, là những tế bào chết có màng dày hóa gỗ ít nhiều, khá cứng rắn để làm nhiệm vụ nâng đỡ cho cây.
2 3 4 5 7 3 5 4 6 1
Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu cuống lá cây Dâu tằm Chú thích: 1-Lông; 2-Biểu bì; 3-Mô mềm vỏ; 4-Trụ bì;
5-Mô mềm ruột; 6- Mô cứng Vi phẫu gân lá
Biểu bì trên và dưới là một lớp tế bào mỏng nối tiếp nhau. Biểu bì trên gồm tế bào khá lớn, có lông chứa nang thạch, đơn bào hoặc đa bào. Biểu bì dưới tế bào nhỏ hơn, có ít lông chứa nang thạch, nhưng nhiều lỗ khí hơn. Trong gân chính, dưới biểu bì có 2 đám mô dày, đám dưới dày và rộng hơn. Mô mềm chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai hay hình phiến. Giữa gân lá có 1 hoặc 2 bó libe gỗ, xung quanh libe có sợi. Cung libe gỗ hình chữ U, gỗ phía trên, libe phía dưới, mạch gỗ xếp thành dãy xen kẽ với các dãy mô mềm gỗ. Phiến lá gồm 1 hàng mô giậu, chứa diệp lục, mô khuyết có tế bào hình tròn hay nhiều cạnh, chứa tinh thể calci oxalat.
Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu gân lá cây Dâu tằm
Chú thích: 1-Lông che chở; 2-Biểu bì; 3-Mô mềm vỏ; 4-Gỗ; 5- libe; 6- phiến lá. 1 2 1 3 5 6 1 4 3 5 6 3 4 2
3.1.3.Kết quả tiêu bản bột lá dâu tằm
Đặc điểm bột lá : Bột mịn, màu lục xám, không vị, thơm mùi đặc trưng của lá cây Dâu tằm, soi dưới kính hiển vi thấy có các đặc điểm: Bào thạch, tinh thể calci oxalat, mảnh mạch, lông che chở.
Hình 3.5: Đặc điểm bột lá cây Dâu tằm
Chú thích:1- Bào thạch; 2,3- Tinh thể Calci oxalat ; 4, 5, 6-Mảnh mạch ; 7- Lông che chở
3.1.4. Xác định tên khoa học
Phân tích đặc điểm hình thái của thân, lá, hoa; quan sát đặc điểm giải phẫu của các bộ phận trên, dựa vào ý kiến của các chuyên gia thực vật học, chúng tôi khẳng định tên khoa học của mẫu cây Dâu tằm là: Morus alba L., họMoraceae (Dâu tằm).
3.2. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học
Định tính glycosid tim
1 2 3
4 5 6
Lấy 3g dược liệu, chiết soxhlet với n-hexan 1 giờ. Bã dược liệu sấy khô, cho vào bình cầu, đun hồi lưu với ethanol 40% trong 1 giờ. Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, thêm khoảng 3ml chì acetat 30%, khuấy đều. Lọc loại tủa, thử dịch lọc vẫn còn tủa với chì acetat, cho thêm 1ml chì acetat nữa vào dịch chiết, khuấy và lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Cho toàn bộ dịch lọc vào bình gạn và lắc kỹ với hỗn hợp chloroform : ethanol tỷ lệ 4:1 (3 lần, mỗi lần 5ml), gạn lấy lớp chloroform vào cốc có mỏ khô sạch, loại nước bằng natri sulfat khan. Chia dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thuỷ cho đến khô. Cắn còn lại để làm các phản ứng định tính sau:
Phản ứng Liebermann
Hòa tan cắn trong ống nghiệm 1 bằng 1ml anhydrid acetic, lắc đều. Nghiêng ống 450
, cho từ từ theo thành ống 1ml H2SO4 đặc. Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp xuất hiện vòng màu đỏ tím thì dương tính..
Phản ứng Baljet
Hòa tan cắn trong ống nghiệm 2 bằng khoảng 1ml ethanol 90%, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính.
Phản ứng Legal:
Hòa tan cắn trong 0,5ml ethanol 90%. Nhỏ 1 giọt thuốc thử Natrinitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều, nếu thấy xuất hiện màu đỏ cam thì dương tính.
Định tính alcaloid
Lấy 2g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50ml. Thêm 15 ml dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N. Đun đến sôi, để nguội. Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml.
Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9-10. Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml). Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natrisulfat khan. Dịch chiết đem lắc với H2SO4 1N
hai lần, mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết nước chia đều vào ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml để làm các phản ứng sau:
Phản ứng với thuốc thử Mayer
Thêm 2-3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
Thêm 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính.
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff
Thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendoff, nếu thấy xuất hiện kết tủa da cam thì phản ứng dương tính.
Chuẩn bị:
Lấy dược liệu đã làm nhỏ, cho nước ngập dược liệu (cách bề mặt dược liệu khoảng 2cm), đun sôi trong 30 phút. Sau 30 phút, lấy dịch chiết ra, lọc nóng được dịch lọc. Dịch lọc lại, đem cô đến cắn (cắn toàn phần).
Định tính saponin Quan sát hiện tượng tạo bọt
Hòa tan một ít cắn vào khoảng 5ml nước cất. Đun cách thủy 10 phút, lọc qua bông lấy dịch chiết vào ống nghiệm to. Thêm nước cất đến khoảng 10ml, bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát cột bọt thấy cột bọt bền sau 15 phút thì dương tính.
Định tính flavonoid
Hòa tan cắn vào ethanol 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc đem làm các phản ứng:
Phản ứng với hơi amoniac (NH3)
Nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ amoniac đặc, quan sát nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng thì dương tính.
Cho dịch lọc vào ống nghiệm, nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10% nếu thấy dịch vẩn đục màu vàng thì dương tính.
Phản ứng Cyanidin
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1ml dịch lọc, 1 ống thêm ít bột magie kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt HCl đậm đặc, ống còn lại để đối chiếu.
Khi phản ứng xong quan sát nếu thấy ống phản ứng xuất hiện màu đỏ cam đậm hơn ống đối chiếu thì dương tính.
Phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid
Cho khoảng 1ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt dung dịch FeCl3
5%, lắc đều nếu thấy xuất hiện màu xanh đen thì dương tính. Định tính coumarin
Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm các phản ứng:
Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch lọc: + Ống 1: thêm 0,5ml NaOH 10%.
+ Ống 2: để nguyên.
Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng + Ống 1: có tủa đục màu vàng.
+ Ống 2: trong suốt.
Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4ml: + Ống 1: trong suốt.
+ Ống 2: có tủa đục.
Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì dương tính. Định tính anthranoid
Phản ứng Borntraeger
Hòa tan một ít cắn vào 10ml H2SO4 1N. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn. Chiết bằng 10ml chloroform, gạn lấy lớp
chloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1ml, thêm 1ml NaOH 10% vào, lắc nhẹ, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng dương tính.
Định tính acid hữu cơ
Hòa tan cắn trong nước nóng, để nguội rồi lọc qua giấy lọc gấp nếp. Cho vào ống nghiệm nhỏ khoảng 2ml dịch lọc, thêm một ít tinh thể Na2CO3 nếu thấy có bọt khí bay lên thì dương tính.
Định tính tanin
Hòa tan cắn trong nước nóng. Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc. Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2ml dịch lọc.
+ Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì dương tính.
+ Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì dương tính.
+ Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì dương tính.
Định tính đường khử
Hòa tan cắn vào 1ml nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc. Thêm vào đó 1ml dung dịch thuốc thử Felling A và 1ml dung dịch thuốc thử Felling B.
Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì dương tính.
Định tính acid amin
Hòa tan cắn vào 2ml nước nóng. Lọc nóng, lấy dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 5 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thủy 2 phút nếu thấy xuất hiện màu tím thì dương tính.
Định tính chất béo
Hòa tan cắn vào 2ml nước nóng, lọc nóng. Nhỏ 1 giọt dịch chiết trên lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi, nếu để lại vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng dương tính.
Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh lá thì dương tính.
Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm một ít cắn khô, hòa tan trong 2ml chloroform và 1ml anhydrid acetic. Để ống nghiệm nghiêng 450, thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm thấy mặt phân cách có vòng tím đỏ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá thì dương tính.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết
quả Kết luận
1 Saponin Hiện tượng tạo bọt ++ Có
2 Alcaloid
TT.Mayer -
Không TT. Dragendorff -
TT. Bouchardat -
3 Anthranoid Phản ứng Bomtraeger - Không
4 Glycosid tim Phản ứng Liebermann - Không Phản ứng legal - Baljet - Keler Kiliani - 5 Flavonoid Phản ứng cyanidin +++ Có Phản ứng với NH3 ++ NaOH 10% - Fe(CL)3 +++
7 Tanin Fe(Cl)3 5% +++ Có Gelatin 1% Pb(CH3COO)2 10% +++ Cu(CH3COO)2 +++
8 Đường khử TT.Fehling - Không
9 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không
10 Sterol H2SO4 đặc/anhydrid
acetic - Không
11 Caroten H2SO4 đặc + Có
12 Polysaccharid TT.lugol - Không
13 Acid amin TT.Ninhydrin - Không
14 Acid hữu cơ Bột Na2CO3 - Không
Ghi chú: (-) âm tính, (+) dương tính, (+++) dương tính rõ
Nhận xét: Bằng các phản ứng hóa học sơ bộ cùng với các nghiên cứu trước đó, nhận thấy dược liệu lá Dâu tằm có chứa các nhóm hợp chất tanin, flavanoid, saponin, caroten, alcaloid, acid béo.
3.3. Phân lập một số hợp chất trong lá Dâu tằm 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ lá Dâu tằm 3.3.1. Chiết các phân đoạn từ lá Dâu tằm
Lá dâu được thu hái, rửa sạch, phơi và sấy khô ở 50o
C, nghiền nhỏ thu được bột thô. Lấy 6,0 kg bột khô (đã trừ độ ẩm) đem ngâm chiết với 9,0 lít methanol/lần x 4 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 48 giờ. Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 520 g cắn chiết methanol. Cắn chiết được phân bố vào nước cất vừa đủ và tiến hành chiết lần lượt với n-hexan, ethylacetat. Các dịch chiết n-hexan, ethylacetat và phần nước còn lại được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cắn n-hexan (A, 60 g), cắn ethylacetat (B, 75 g) và cắn nước (C, 42 g).
Hà thủ ô đỏ
Dịch chiết Methanol
Chiết kỹ với Methanol, 4 lần x 9L
Cao chiết tổng Methanol (520g)
Lá dâu tằm đã rửa sạch, phơi khô, xay thành bột
Lọc, cất loại dung môi
Dùng lắc các phân đoạn Lưu làm đối chiếu
1. Hòa tan trong nước cất
2. Lắc với n-hexan, 2 lần
Dịch chiết n – hexan
Cao chiết n-hexan (60g)
Cất thu hồi dung môi
Dịch chiết nước
Lắc với EtOAc
Dịch chiết ethyl acetat
Thu hồi dung môi mmôi
Dịch chiết n – hexan Cao chiết EtOAc (75g)
Cắn nước
3.3.2. Phân tích các chất bằng sắc ký cột
Cắn ethylacetat (B, 50 g) được hòa tan trong lượng dung môi vừa đủ và trộn với silicagel (150 g), sau đó cất loại dung môi để được dạng bột tơi, tiến