Sơ đồ phân lập cắn ethyl acetat được trình bày theo hình 3.9:
Hình 3.9. Sơ đồ phân lập từ cắn ethyl acetat
Giai đoạn phân lập 1
Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel loại dung cho sắc ký cột cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck).
- Chuẩn bị cột
+ Cột sắc ký có đường kính 5 cm, được lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng cồn .
+ Chất nhồi cột: Silica gel được hoạt hóa ở 1000C/2h trong tủ sấy rồi lấy ra để nguội trong bình hút ẩm.
+ Lót 1 lớp bông ở đáy cột, đổ vào cột 40ml dichlomethan mở khóa cho dung môi chảy từ từ để đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài. Khi lớp dung môi còn khoảng 3 cm thì khóa cột.
+ Nhồi cột: trộn silicagel với một lượng vừa đủ dung môi dichlomethan thành hỗn dịch rồi đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén, thoát
n-hexan
EtOAc - MeOH (5:1, v/v, 2,5L)
ND4
n- hexan- EtOAc(5:1→1:1, v/v, mỗi phân đoạn 600 mL) CHCl
3- MeOH (10:1→1:1, v/v, mỗi phân đoạn 500mL)
P1,P2,P3, P4,P6,P7 Phân lập 1 Phân lập 2 S1 P5 Cắn EtOAc
28
hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt, rửa thành cột bằng dichlomethan. Chiều dài cột silicagel là 15 cm.
+ Ổn định cột: kiểm tra để đảm bảo cột ở vị trí thẳng đứng, nén cột bằng cách dùng quả bóp cao su gõ nhẹ, đều, đối xứng quanh thân cột tới khi không còn bọt khí trong cột. Để cột ổn định trong 15 h.
- Tiến hành sắc ký cột hấp phụ
+ Mở khóa cột cho dung môi dichlomethan chảy đến sát bề mặt silicagel, khóa cột lại.
+ Đưa chất lên cột: 25 g cắn ethyl acetat được hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, dung dịch thu được trộn đều với khoảng 20 g hạt silicagel pha thuận đã hoạt hóa. Để bốc hơi dung môi ở nhiệt độ phòng trong tủ hút, tới khi bột khô đều, mịn và tơi. Nghiền hỗn hợp bột trong cối sứ. Đưa bột tẩm mẫu từ từ lên cột, vừa cho vừa gõ nhẹ, vừa cho từ từ dung môi luôn sát bề mặt silica gel. Lót một lớp bông mỏng lên bề mặt cột silica gel.
+ Rửa giải bằng hỗn hợp dung môi dichlomethan và methanol theo tỷ lệ thay đổi như sau: 100:0, 50:1, 30:1, 10:1, 4:1, 1:1, 0:100.
+ Điều chỉnh Tốc độ rửa giải 1ml/phút.
+ Hứng các phân đoạn vào từng bình hứng riêng biệt, mỗi bình hứng khoảng 10ml dịch rửa giải.
+ Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM pha thuận với hệ dung môi dichlomethan : methanol (7:1), và SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH:H2O (1:1). Các sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng UV254nm và UV365nm, sau đó đốt bản mỏng bằng H2SO4
10%/ethanol và hơ nóng bằng bếp điện.
+ Gộp các bình hứng có sắc ký đồ giống nhau, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 7 phân đoạn ký hiệu là P1~P7.
29
Áp dụng phương pháp sắc ký cột hấp phụ với chất nhồi cột là silicagel loại dung cho sắc ký cột cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck).
- Chuẩn bị cột
+ Cột sắc ký có đường kính 3 cm, được lắp thẳng đứng trên giá, tráng sạch bằng cồn .
+ Chất nhồi cột: Silica gel được hoạt hóa ở 100oC/2 h trong tủ sấy rồi lấy ra để nguội trong bình hút ẩm.
+ Lót 1 lớp bông ở đáy cột, đổ vào cột 40 ml ethyl acetat mở khóa cho dung môi chảy từ từ để đẩy hết bọt khí trong lớp bông ra ngoài. Khi lớp dung môi còn khoảng 3 cm thì khóa cột.
+ Nhồi cột: trộn silicagel với một lượng vừa đủ dung môi ethyl acetat thành hỗn dịch rồi đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ quanh thành cột để hạt nén, thoát hết bọt khí và phân bố đều, bằng mặt, rửa thành cột bằng ethyl acetat. Chiều dài cột silicagel là 30 cm
+ Ổn định cột: kiểm tra để đảm bảo cột ở vị trí thẳng đứng, nén cột bằng các dung quả bóp cao su gõ nhẹ, đều, đối xứng quanh thân cột tới khi không còn bọt khí trong cột. Để cột ổn định trong 15 h.
- Tiến hành sắc ký cột hấp phụ
+ Mở khóa cột cho dung môi ethyl acetat chảy đến sát bề mặt silicagel, khóa cột lại.
+ Đưa chất lên cột: 8,3 g phân đoạn P5 được hòa tan trong một lượng tối thiểu methanol, dung dịch thu được trộn đều với khoảng 10 g hạt silicagel pha thuận đã hoạt hóa. Để bốc hơi dung môi ở nhiệt độ phòng trong tủ hút, tới khi bột khô đều, mịn và tơi. Nghiễn hỗn hợp bột trong cối sứ. Đưa bột tẩm mẫu từ từ lên cột, vừa cho vừa gõ nhẹ, vừa cho từ từ dung môi luôn sát bề mặt silica gel. Lót một lớp bông mỏng lên bề mặt cột silica gel.
+ Rửa giải bằng hỗn hợp dung môi ethyl acetat và methanol theo tỷ lệ 5:1. Điều chỉnh Tốc độ rửa giải 1 ml/phút. Hứng các phân đoạn vào từng ống hứng riêng biệt, mỗi bình hứng khoảng 4ml dịch rửa giải.
30
+ Dịch rửa giải được kiểm tra bằng SKLM pha thuận với hệ dung môi dichlomethan : methanol : acid formic (5:1:0,1), và SKLM pha đảo với hệ dung môi MeOH: H2O (1:1). Các sắc ký đồ được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng UV254nm và UV365nm, sau đó đốt bản mỏng bằng H2SO410%/ethanol và hơ nóng bằng bếp điện. Gộp các bình hứng có sắc ký đồ giống nhau, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 10 phân đoạn ký hiệu là P5.1~P5.10.
Phân đoạn P5.3 thu được cho kết tinh trong methanol, rửa kết tinh nhiều lần bằng aceton thu được hợp chất S1 (21 mg).
Tinh chế phân đoạn nhỏ P5.2 (260 mg) bằng sắc ký cột pha đảo YMC C-18 sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH- H2O(4:1, v/v, 1,5L) thu được hợp chất ND4 (13 mg).