Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) thuộc bộ Apiales, họ Ngũ gia bì - Araliace, chi Nhân sâm - Panax L, hay còn gọi là tam thất rừng, sâm tam thất [4,8,17,22].
Đặc điểm thực vật
Cây thảo sống nhiều năm, cao 25 - 75 cm. Thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều chỗ lõm do vết thân để lại; ít khi phân nhánh; đƣờng kính 1,5 - 3 cm. Mỗi khóm thƣờng có 1 thân mang lá. Thân mọc thẳng, nhẵn; đƣờng kính 0,3 - 0,6 cm. Lá kép chân vịt, gồm 1 - 3 cái, mọc vòng ở ngọn; có cuống dài 5 - 10
21
cm. Lá chét 5; có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, nhọn 2 đầu, dài 5 - 13cm, rộng 2 - 4 cm; mép có răng cƣa, hoặc ở một số ít cây non có thể gặp dạng xẻ lông chim nông, mép của thuỳ nông cũng khía răng cƣa. Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn, cuống cụm hoa dài 5 - 10cm. Số hoa trên một tán gồm 30 - 80 cái màu vàng xanh,cuống hoa mảnh, dài 1- 1,5 cm. Hoa màu vàng xanh, 5 lá đài nhỏ; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2 ô, đầu nhụy thƣờng chẻ đôi. Quả mọng, gần hình cầu dẹt, đƣờng kính 0,6 - 1,2 cm, khi chín màu đỏ. Hạt 1 hoặc 2, gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt. Mùa hoa tháng 4 - 5, quả tháng 5 - 9 [6,18].
Hình 1.8. Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) Bộ phận dùng
Thân rễ cây Tam thất hoang - Rhizoma Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng.
Nơi sống và thu hái
Có ở Trung Quốc và Việt Nam. Loài có phân bố hẹp ở Việt Nam. Xuất hiện ở huyện Sa Pa (núi Hàm Rồng - thị trấn Sa Pa và xã Tả Phìn) và huyện Bát Xát (xã Trung Lèng Hồ), tỉnh Lào Cai. Thu hoạch thân rễ ở những cây lâu năm. Phơi hoặc sấy khô [7,18,22].
Thành phần hóa học
Các kết quả nghiên cứu phân tích và tách chiết thành phần hóa học của cây TTH chỉ ra rằng phần rễ của cây này có chứa nhiều saponin khung oleanan với hàm lƣợng tƣơng đối cao cùng một số saponin khung dammaran với nồng độ thấp. Năm 1985, nhóm nghiên cứu Trung Quốc phân lập 2
22
saponin khung oleanan, stipuleanoside R1 và R2, từ dịch chiết methanol của rễ cây này [57]. Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Toyama, Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran bao gồm các ginsenoside Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lƣợng nhỏ từ dich chiết ethanol của cây TTH đƣợc thu hái ở Trung Quốc [58]. Gần đây, năm 2010, đặc biệt từ rễ của cây TTH ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc công bố xác định 15 hợp chất saponin (1-
15, hình 1.9) khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin A
methyl ester (1), 3 hợp chất polyyne (16-18), một sesquitecpen (19) và một acid béo (20) [46].
Hình 1.9. Thành phần hóa học của cây TTH
Ngoài ra TTH cũng chứa các thành phần nhƣ triterpenoid, tinh dầu, đƣờng khử tự do, acid amin, acid hữu cơ, đƣờng khử, các nguyên tố vi lƣợng, và polyuronic [12,13]. Các thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu ở cả 2
23
loài SVD và TTH cũng tƣơng tự nhau (nhƣ: β-farnesen, germacren D, spatulenol) [22].
Tác dụng dƣợc lý
Trong các saponin của TTH, hợp chất saponin 1, saponin 2, polyyne 16 và polyyen 17 thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ máu (HL - 60) và ruột kết (HCT-116) với giá trị IC50 từ 0,13 đến 41,45 μM theo cơ chế gây chết tự nhiên của tế bào - apoptosis qua phân tích hình thái tế bào, phân mảnh DNA và biểu hiện trên protein kích thích quá trình apoptosis. Trong một công bố khác về hoạt tính sinh học, các hợp chất saponin 6-11 biểu hiện ức chế nhân
tố sao chép NF - κB với giá trị IC50 từ 3,1 đến 18,9 μM trên dòng tế bào HepG2 liên quan đến khả năng chống ung thƣ và kháng viêm [45].
Ở trong nƣớc, năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát: Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đƣờng uống với liều chết LD50 = 8,8 g/kg. Cao saponin toàn phần của TTH thể hiện tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl diandehyd ở nồng độ 25, 50, 100μg/ml [12].
Năm 2009, nghiên cứu tác dụng dƣợc lý của TTH thu hái ở Sapa, Lào Cai của Viện Dƣợc liệu chỉ ra rằng phân đoạn saponin thể hiện hoạt tính chống oxi hóa - lipid peroxidation và dịch chiết tổng ethanol có tác dụng chống trẩm cảm - antistress ở liều 44 - 176 mg/kg trên chuột [14].
Công dụng
TTH có tác dụng tán ứ. Sách đỏ Việt Nam, 2007, ghi “tất cả bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thƣờng đƣợc dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cƣờng sinh dục, chống stress. Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần” [6].
24
CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu
Để thực hiện đƣợc nghiên cứu in vitro, đề tài cần tiến hành lấy mẫu
máu của ngƣời tình nguyện khỏe mạnh. Do đó, cần tuân thủ theo hiệp ƣớc Helsinki và hƣớng dẫn quốc gia về khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu y sinh học trên đối tƣợng nghiên cứu là con ngƣời, đề tài đƣợc thực hiện sau khi Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Khoa Y - Dƣợc thông qua.
Những khía cạnh đạo đức chính liên quan đến quyền lợi của tình nguyện viên tham gia nghiên cứu:
Mô tả nghiên cứu và quy trình lấy mẫu máu
Đề tài tuyển ngƣời tình nguyện là các sinh viên của khoa Y- Dƣợc, Đại học Quốc Gia Hà Nội (ĐHQGHN) đạt tiêu chuẩn để tham gia vào nghiên cứu. Các tình nguyện viên đƣợc lấy 3ml máu lúc đói, và đo các chỉ số huyết học. Quá trình lấy máu đƣợc thực hiện bởi bác sỹ hoặc y tá có chuyên môn.
Địa điểm lấy máu: Khoa Xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện 19.8 - Bộ Công An.
Lợi ích và nguy cơ đối với đối tượng nghiên cứu
Lƣợng máu lấy ở mỗi tình nguyện viên là 3ml. Điều này không gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe của ngƣời cho máu. Việc tham gia cho máu của ngƣời tình nguyện sẽ đƣợc ghi nhận trong lời cảm ơn tại các báo cáo.
Cam kết chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu
Ngƣời tình nguyện chỉ tham gia vào nghiên cứu khi đủ tiêu chuẩn, đƣợc giải thích và hiểu rõ các lợi ích, nguy cơ của việc tham gia nghiên cứu. Ngƣời tình nguyện có quyền từ chối tham gia và rút lui khỏi nghiên cứu mà không chịu sự ràng buộc nào.
Sự bảo mật thông tin
Những thông tin cá nhân của tình nguyện viên tham gia nghiên cứu chỉ nhằm mục đích phục vụ cho nghiên cứu, không đƣợc sử dụng cho bất kỳ mục đích nào khác.
25
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
SVD các phân đoạn: cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n - butanol, phân đoạn cao chiết bằng dung môi ethyl acetat và phân đoạn cao chiết bằng dung môi ete. Mẫu nghiên cứu thân rễ SVD (Panax bipinnatifidus Seem.) đƣợc thu hái ở Sapa, Lào Cai vào tháng 3 - 2016 và đƣợc giám định thực vật học bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu. Mẫu tiêu bản (PB - 001/2016) đƣợc lƣu giữ tại Khoa Y - Dƣợc, ĐHQGHN.
Hình 2.1. Sơ đồ chiết thu các phân đoạn SVD
TTH các phân đoạn: cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol, phân đoạn cao chiết bằng dung môi
n-hexan và phân đoạn cao chiết bằng dung môi nƣớc.Thân rễ TTH đƣợc thu hái tự nhiên ở sƣờn đông bắc dãy Hoàng Liên Sơn và một vài nhánh phụ cận kề, thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và Sa Pa của tỉnh Lào Cai. Mẫu đƣợc giám định tên khoa học là TTH - Panax stipuleanatus H. T. Tsai et
Mẫu khô (500g)
1. Ngâm cồn 70%, nhiệt độ phòng
2. Chiết cồn 70%, 3h/lần; DL/DM: 1/7, (70o
C) 3. Thu hồi dung môi dƣới áp suât giảm
Cao tổng (95,8 g; 19,2%)
1. 95g cao tổng. Hòa nƣớc
2. Chiết lần lƣợt với các dung môi ete, ethyl acetat, n-butanol (3 lần x 500ml/lần)
3. Thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm
Ete (5,82 g; 6,1%) Ethyl acetat (2,7 g; 2,8 %) n-butanol (21,7 g; 22,8%)
26
K. M. Feng bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu.
Hình 2.2. Sơ đồ chiết thu các phân đoạn TTH
Dƣợc liệu SVD và TTH sau khi sơ chế, làm khô, ngâm cồn 70% trong 3 ngày - 2 tuần ở nhiệt độ phòng. Chiết hồi lƣu bằng cồn 70% 3 lần, mỗi lần 3h, tỷ lệ 1: 7 (dƣợc liệu: dung môi) đối với SVD và tỷ lệ 1:8 (dƣợc liệu: dung môi) đối với TTH, ở nhiệt độ 70oC. Dịch chiết đƣợc gom lại và lọc qua giấy lọc. Cô quay dƣới áp suất giảm đến kiệt thu đƣợc cao tổng SVD (ký hiệu: PBT), cao tổng TTH (ký hiệu PST). Cho cao tổng dƣợc liệu khuếch tán vào nƣớc cất. Chiết phân bố lần lƣợt với từng loại dung môi là ete, ethyl acetat và
n-butanol (3 lần) đối với SVD và n-hexan, n-butanol, nƣớc (3 lần) đối với
Mẫu khô (1kg)
1. Ngâm cồn 70%, 2 tuần, nhiệt độ phòng 2. Chiết cồn 70%, 3h/lần; DL/DM: 1/8, (70o
C) 3. Thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm
Cao tổng
(475 g, 4,75%, độ ẩm: 0,263%)
1. Hòa nƣớc
2. Chiết lần lƣợt với các dung môi n-hexan, n- butanol, nƣớc.
3. Thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm
n-hexan (4,74 g, 0,47% Độ ẩm: 0,179%) n-butanol (65,9, 6,6%g, Độ ẩm: 0,148%) Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác định độ ẩm 1. 350g PĐ nƣớc 1. 350g PĐ nƣớc 1. 350g PĐ nƣớc 1. 350g PĐ nƣớc 1. 350g PĐ nƣớc 2. CC. Diaion 3. Rửa giải bằng nƣớc PĐ nƣớc (295 g, 0,61%, Độ ẩm: 0,369%)
27
TTH. Các dịch chiết mỗi phân đoạn đƣợc gom lại, cô quay dƣới áp suất giảm để loại dung môi đến khối lƣợng không đổi thu đƣợc các phân đoạn cao chiết tƣơng ứng.
Các phân đoạn tƣơng ứng của SVD là phân đoạn cao chiết bằng dung môi ete (ký hiệu: PBEt), phân đoạn cao chiết bằng dung môi ethyl acetat (ký hiệu: PBEA) và phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol (ký hiệu:
PBBt). Các phân đoạn cao chiết SVD đƣợc tiến hành tại khoa Y- Dƣợc, ĐHQGHN, do TS. Nguyễn Hữu Tùng cung cấp (Hình 2.1).
Các phân đoạn tƣơng ứng của TTH là phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-hexan (ký hiệu: PSnH), phân đoạn cao chiết bằng dung môi n- butanol (ký hiệu: PSBt), phân đoạn chiết với nƣớc tiếp tục chạy sắc kí Diaion và rửa giải bằng nƣớc để thu phân đoạn cao chiết bằng dung môi nƣớc (ký hiệu: PSW). Các phân đoạn dịch chiết TTH đƣợc tiến hành tại khoa Hóa thực vật viện Dƣợc liệu, do PGS.TS. Đỗ Thị Hà cung cấp (Hình 2.2).
2.3. Phƣơng pháp
Thời gian đông máu in vitro đƣợc đo bằng máy ACL TOP500 theo
nguyên lý đo quang (phƣơng thức phát hiện ánh sáng tán xạ), dựa theo mô hình của (Li C.,et al. 2013) [44].
Mục đích
- Xây dựng mô hình đánh giá tác dụng chống đông máu trên in vitro
- Nghiên cứu tác dụng chống đông máu trên in vitro của các phân đoạn
dịch chiết SVD và TTH thông qua các chỉ số PT và APTT
Chuẩn bị
Mẫu phẩm:
Huyết tƣơng từ ngƣời tình nguyện khỏe mạnh. Mẫu máu toàn phần đƣợc thu thập từ ngƣời tình nguyện khỏe mạnh có độ tuổi từ 20-25. Lấy khoảng 3ml máu toàn phần từ tĩnh mạch ngƣời tình nguyện khỏe mạnh cho vào ống chống đông chứa sodium citrat 3,8% (1:9, v/v). Ly tâm 3000 vòng/ phút trong 15 phút. Sau đó đo các giá trị PT và APTT.
Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm Nƣớc (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm
28
Tiêu chuẩn lựa chọn: Ngƣời có các chỉ số PT và APTT bình thƣờng, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, không đang sử dụng các thuốc tác dụng trên quá trình đông máu, tiêu fibrin.
Tiêu chuẩn loại trừ: Mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, ngƣời mới cho máu với lƣợng > 450ml trong vòng 28 ngày trƣớc.
Việc lấy máu đƣợc thực hiện vào buổi sáng. Các tình nguyện viên cần nhịn ăn 12h trƣớc khi lấy máu.
Hóa chất:
Dung dịch DMSO nguyên chất, heparin, nƣớc cất. Các phân đoạn cao chiết của SVD: Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol, phân đoạn cao chiết bằng dung môi ethyl
acetat, phân đoạn cao chiết bằng dung môi ete.
Các phân đoạn cao chiết của TTH: Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n- butanol, phân đoạn cao
chiết bằng dung môi n- hexan, phân đoạn cao chiết bằng dung môi nƣớc. Cao chiết SVD và TTH ở các phân đoạn đƣợc hoà tan trong dung môi DMSO 1%, sử dụng nồng độ nghiên cứu: 0,5; 1; 2; 5mg/ml. Dùng DMSO 0,1% làm chứng âm, heparin 0,2UI/ml (HP 0,2UI/ml) làm chứng dƣơng. Mẫu trắng là nƣớc cất.
Dụng cụ:
Ống đựng máu không chứa chất chống đông và giá để ống đựng máu. Ống falcon và giá để ống falcon
Ống eppendorf thể tích 1,5ml và giá để ống eppendorf. Pipet đơn kênh thể tích 1-10,0µl, 20-200µl, 100-1000µl; đầu côn tƣơng ứng và giá để pipet.
Bút dạ, giấy parafilm, găng tay, khẩu trang y tế. Cốc đựng đầu côn bẩn. Thiết bị:
Máy đo thời gian PT và APTT: Máy ACL TOP500 của hãng IL (Instrumentation Laboratory - Mỹ).
29
Hình 2.4. Máy ACL TOP500 và nguyên lý đo quang của máy ACL TOP 500
Tiến hành
Thu huyết tƣơng vào ống falcon vô khuẩn. Chia 450µl huyết tƣơng vào mỗi ống máu đã đƣợc loại sạch chất chống đông. Thêm 50µl hóa chất gồm nƣớc cất, DMSO 0,1%, heparin 0,2UI/ml, các nồng độ dịch chiết dƣợc liệu các phân đoạn (0,5, 1, 2, 5mg/ml) vào mỗi ống theo thứ tự sau và ủ trong 2-3 phút.
- Ống 1: Nƣớc cất (mẫu trắng).
- Ống 2: Dung dịch DMSO 0,1% (chứng âm).
- Ống 3: Dung dịch Heparin 0,2UI/ml (chứng dƣơng).
- Ống 4: Dịch chiết SVD hoặc TTH nồng độ 0,5mg/ml.
- Ống 5: Dịch chiết SVD hoặc TTH nồng độ 1mg/ml.
- Ống 6: Dịch chiết SVD hoặc TTH nồng độ 2mg/ml.
- Ống 7: Dịch chiết SVD hoặc TTH nồng độ 5mg/ml.
Tiến hành đo chỉ số PT và APTT bằng máy ACL TOP500. Lặp lại thí nghiệm 5 lần ứng với mỗi phân đoạn.
30
Phƣơng pháp phân tích số liệu:
So sánh giữa các nhóm đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phƣơng sai one - way ANOVA sau đó là Tukey hoặc Dunnet T3 bằng phần mềm SPSS 16.0. Dữ liệu đƣợc biểu diễn ở dạng giá trị trung bình ± SE, đƣợc xem xét có ý nghĩa thống kê khi các giá trị p <0,05.
31
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả thực nghiệm
Trong phần này, ta sẽ nhận xét về 2 chỉ số là PT(s) chỉ số đánh giá khả năng đông máu ngoại sinh và APTT(s) chỉ số đánh giá khả năng đông máu nội sinh.
3.1.1. Sâm vũ diệp
Phân đoạn cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%
Trên thời gian đông máu in vitro, phân đoạn cao tổng chiết bằng dung
môi ethanol 70% của SVD không làm thay đổi thời gian PT(s) và APTT(s) so với lô chứng DMSO 0,1% ở tất cả các mức liều.
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của PBT trên thời gian đông máu in vitro
Lô n PT(s) APTT(s) Nƣớc cất 5 11,90 ± 0,20 34,48 ± 0,63 DMSO 0,1% 5 11,86 ± 0,20 34,52 ± 0,63 HP 0,2UI/ml 5 11,82 ± 0,28 48,88 ± 2,67* PBT 0,5mg/ml 5 11,82 ± 0,11 34,62 ± 0,37 PBT 1mg/ml 5 11,76 ± 0,14 35,12 ± 0,33 PBT 2mg/ml 5 11,84 ± 0,14 35,52 ± 0,33 PBT 5mg/ml 5 12,04 ± 019 36,80 ± 0,27 p ANOVA >0,05 <0,001
(*p<0,05 so với chứng DMSO 0,1%. Với n=5; HP = Heparin; PBT phân đoạn cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70% của SVD; PT: Thời gian
Prothrombin; APTT: Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa).
Phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol
Phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol của SVD với các mức
liều 0,5mg/ml và 1mg/ml không làm thay đổi thời gian PT(s) và APTT(s) so