V. Thăm khỏm:
1.10. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG HBsAg VÀ HBV–DNA
1.10.1. Phương phỏp định lượng HBsAg [44]
Hiện nay trờn thị trường đang sử dụng cỏc xột nghiệm định lượng như: Abbott Architect, Roche Elecsys HBsAg II quant. Trong đú dải tuyến tớnh của Abbott 0.05 – 250 IU/mL, dải tuyến tớnh của Elecsys 0.05 – 52.000 IU/ mL
Bảng 1.1: So sỏnh cỏc phương phỏp định lượng HBsAg: Abbott Architect, Roche Elecsys HBsAg II quant
Abbot
Architect HBsAg quant
Roche
Elecsys HBsAg II quant
Pha loĩng Bằng tay Tự động trờn hệ thống
mỏy phõn tớch Tỉ lệ mẫu yờu cầu pha loĩng
bằng tay để đạt được kết quả đo nằm trong dải tuyến tớnh
95% 25%
Thời gian làm việc/ chi phớ
nhõn cụng Tăng Giảm
Dải tuyến tớnh [IU/mL] 0.05 – 250 0.05 - 52000
Tiờu chuẩn húa Chuẩn nội bộ Chất chuẩn quốc tế của WHO
Với nhiều ưu điểm vượt trội, hiện nay xột nghiệm Roche Elecsys HBsAg II quant đang được ỏp dụng rộng rĩi.
Nguyờn lý xột nghiệm của Roche Elecsys HBsAg II quant: Xột nghiệm sandwich một bước.
Thời gian xột nghiệm: 18 phỳt
Pha loĩng: Bước pha loĩng được thực hiện tự động trờn mỏy (tỷ lệ 1:400 trờn E170/cobas e 601/e 602 và 1:100 trờn E2010/cobas e 411).
Diễn dải kết quả: mỏy sẽ tự động tớnh toỏn nồng độ đo được (IU/mL) dựa trờn việc đo Cal1 và Cal2. Trong trường hợp pha loĩng bằng tay, tỷ lệ pha loĩng cần phải đưa vào cụng thức tớnh toỏn thủ cụng để cho ra kết quả cuối cựng.
Tham chiếu: Được chuẩn húa theo chất chuẩn NIBSC (mĩ số: 00/588; WHO chất chuẩn quốc tế lần thứ 2 của HBsAg).
Loại mẫu: huyết thanh được lấy vào ống mẫu chuẩn hoặc ống cú gel phõn tỏch. Huyết tương chống đụng Li-heparin, Na-heparin, EDTA- và citrate
Dải đo: 0.05 – 52000 IU/mL
1.10.2. Phương phỏp định lượng HBV – DNA
Để đỏnh giỏ mức độ nhõn lờn của HBV, chỳng ta cú thể làm cỏc xột nghiệm đối với DNA polymerase hay HBV- DNA. Tuy nhiờn giỏ trị dao động của DNA polymerase khỏ rộng. Do vậy xột nghiệm HBV- DNA thường được sử dụng trong lõm sàng và nghiờn cứu.
Một số phương phỏp định lượng HBV- DNA hay được dựng là: Direct hybridization, phương phỏp chuỗi nhỏnh (b-DNA) và phương phỏp PCR (polymerase chain reaction).
Phương phỏp DIRECT HYBRIDIZATION là kỹ thuật lai ghộp trờn màng lọc hoặc trong mụi trường lỏng, hạn chế về độ nhạy, chỉ phỏt hiện được HBV-DNA từ 5log copies/ml. Hiện nay kỹ thuật này ớt được thực hiện.
Phương phỏp phõn nhỏnh (b-DNA) là kỹ thuật lai ghộp chuyờn biệt nhờ sự khuếch đại tớn hiệu lai ghộp. Kỹ thuật này cho phộp định lượng HBV- DNA nhạy gấp 10-20 lần so với phương phỏp lai ghộp trực tiếp, khả
năng định lượng được HBV- DNA từ 3log copies/ml, nhưng với sự ra đời và những ưu điểm của kỹ thuật PCR nờn phương phỏp này cũng ớt được ỏp dụng hiện nay.
Cú nhiều kỹ thuật PCR khỏc nhau để định lượng HBV- DNA. Như kỹ thuật PCR amplicor của hĩng Roche, cho phộp định lượng được HBV- DNA từ 2,6log copies/ml. Với sự ra đời của kỹ thuật real-time cú độ nhạy cao và cú khả năng định lượng được nồng độ HBV-DNA từ 1,5 log copies/ml đến 11,5 log copies/ml, kỹ thuật này được ỏp dụng rộng rĩi nhất.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU
79 bệnh nhõn viờm gan B mạn tớnh được lựa chọn tại khoa khỏm chữa bệnh theo yờu cầu và khoa tiờu húa bệnh viện Bạch Mai từ thỏng 7 năm 2010 đến thỏng 8 năm 2011.
2.1.1. Tiờu chuẩn lựa chọn bệnh nhõn vào nhúm nghiờn cứu
- Bệnh nhõn thuộc cả hai giới, tuổi từ 15 đến 75 - HBsAg dương tớnh > 6 thỏng
- ALT tăng trờn 2 lần giới hạn cao tại thời điểm khỏm bệnh hay từng đợt trong 1 năm
- Chưa điều trị thuốc khỏng vi rỳt
2.1.2. Tiờu chuẩn loại trừ
- Đồng nhiễm HCV, HIV, HAV - Xơ gan, K gan
- Đĩ cú tiền sử điều trị thuốc khỏng vi rỳt trong vũng 6 thỏng
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
Phương phỏp mụ tả cắt ngang tiến cứu
2.2.1. Phương phỏp thu thập thụng tin
Tất cả những bệnh nhõn được hỏi bệnh, thăm khỏm và làm xột nghiệm theo mẫu bệnh ỏn thống nhất. Cụ thể cỏc bước như sau:
- Hỏi bệnh
- Thăm khỏm lõm sàng - Xột nghiệm sinh húa
- Xột nghiệm định lượng HBsAg, HBV – DNA, HBeAg - Siờu õm ổ bụng
2.2.2. Phương phỏp định lượng HBsAg [44]
Tiến hành tại khoa Vi Sinh bệnh viện Bạch Mai, sử dụng kỹ thuật Roche Elecsys HBsAg II quant. Đõy là phương phỏp mới cú rất nhiều ưu điểm so với phương phỏp trước kia của Abbott Architect .
Nguyờn lý xột nghiệm: Xột nghiệm sandwich một bước Thời gian xột nghiệm: 18 phỳt
Pha loĩng: Bước pha loĩng được thực hiện tự động trờn mỏy (tỷ lệ 1:400 trờn E170/cobas e 601/e 602 và 1:100 trờn E2010/cobas e 411)
Diễn dải kết quả: mỏy sẽ tự động tớnh toỏn nồng độ đo được (IU/mL) dựa trờn việc đo Cal1 và Cal2. Trong trường hợp pha loĩng bằng tay, tỷ lệ pha loĩng cần phải đưa vào cụng thức tớnh toỏn thủ cụng để cho ra kết quả cuối cựng
Tham chiếu: Được chuẩn húa theo chất chuẩn NIBSC (mĩ số: 00/588; WHO chất chuẩn quốc tế lần thứ 2 của HBsAg)
Loại mẫu: huyết thanh được lấy vào ống mẫu chuẩn hoặc ống cú gel phõn tỏch. Huyết tương chống đụng Li-heparin, Na-heparin, EDTA-và citrate
Dải đo: 0.05 – 52000 IU/mL
2.2.3. Phương phỏp định lượng HBV –DNA
Tiến hành tại khoa Vi Sinh bệnh viện Bạch Mai. Nồng độ HBV-DNA được xỏc định bằng Real-time PCR với cặp primer và Taqman Probe nằm trờn vựng gen S, đơn vị tớnh: logcopies/ ml.
2.3. XỬ Lí SỐ LIỆU
Cỏc kết quả được tớnh theo phương phỏp thống kờ y sinh học. Kết quả được tớnh theo tỷ lệ phần trăm, trung bỡnh cộng, độ lệch trung bỡnh. Khi so sỏnh 2 tỷ lệ ỏp dụng test X2, nếu cú ớt nhất một tần số quan sỏt <= 5 thỡ ỏp
dụng test Fisher. So sỏnh trung bỡnh của hai biến định lượng bằng cỏch sử dụng test “T” – Student. Kết quả tớnh được cú độ tin cậy > 95% hay p< 0,05 thỡ so sỏnh cú ý nghĩa thống kờ.
Tỡm hiểu mối tương quan giữa hai biến định lượng với hệ số tương quan tuyến tớnh r:
Nếu 0 <= /r/ < 0.3: hai biến khụng cú tương quan tuyến tớnh Nếu 0.3 <= /r/ <= 0.6: hai biến cú tương quan tuyến tớnh Nếu 0.6 <= /r/ <= 1: hai biến cú tương quan tuyến tớnh chặt
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Đụng Thị Hồi An, Phạm Thị Thu Hà và cộng sự, (2009), “Sự liờn quan kiểu gen vi rỳt viờm gan B với cỏc dạng lõm sàng của viờm gan B”,
Tạp chớ gan mật Việt Nam, (số 9), tr 5-15.
2. Đàm Viết Cương, (1992), “Kớch thước, hỡnh thể, cấu trỳc và sinh lý của virus”, Vi sinh vật y học, Nhà xuất bản đại học và giỏo dục chuyờn nghiệp, tr 31-40.
3. Bựi Hữu Hồng, (2004), “Kiểu gen của virus viờm gan B”, Tạp chớ thụng tin Y dược Hà Nội, tr 29-32.
4. Bựi Hữu Hồng, Phạm Hồng Phiệt, (2003), “Kiểu gen của viờm gan siờu vi B ở bệnh nhõn xơ gan và ung thư gan nguyờn phỏt”, Y học TP. Hồ Chớ Minh, (tập 7), tr 128-133.
5. Trịnh Thị Minh Liờn, (2000), í nghĩa lõm sàng và tiờn lượng viờm gan vi rỳt B dựa vào một số thụng số miễn dịch, Luận ỏn tiến sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội, tr 8-14.
6. Nguyễn Cụng Long, (2007), Nghiờn cứu mối liờn quan giữa nồng độ HBV-DNA trong mỏu với kiểu gen và HbeAg ở người lành và người bệnh gan mạn tớnh, Luận văn thạc sỹ y học, Trường đại học Y Hà Nội, tr 34-64. 7. Hà Văn Mạo, (2000), “Phũng và điều trị bệnh viờm gan B mạn tớnh”,
Tạp chớ thụng tin y dược số đặc biệt chuyờn đề gan mật, tr1-3.
8. Phạm Hồng Phiệt, Nguyễn Phương Thảo, (2010), “Khảo sỏt mối tương quan giữa lượng HBsAg với một số kết quả về virus học và lõm sàng trờn bệnh nhõn viờm gan B mạn tớnh hoạt động chưa điều trị đặc hiệu”, Tạp chớ gan mật, (số 13), tr 5 -6.
9. Nguyễn Trường Sơn, (2005), Nghiờn cứu tỷ lệ cỏc kiểu gen của virus viờm gan B ở một số người lành mang virus và người mắc bệnh gan mạn tớnh, Luận ỏn thạc sỹ Y học, Trường đại học y Hà Nội, tr 30-50.
10. Phạm Song, (2000), “Viờm gan virus”, Bỏch khoa thư bệnh học, Nhà xuất bản y học, tr 341-343.
11. Vũ Thị Tường Võn, (1996), Nghiờn cứu tỡnh trạng nhiễm virus viờm gan B ở phụ nữ cú thai tại Hà Nội và khả năng lõy truyền của HBV từ mẹ sang con, Luận ỏn tiến sĩ, Học viện Qũn Y, tr 1-39.
TIẾNG ANH
12. EiJk der A.A.van, Man de R.A, Niesters H.G.M et al, (2006), “Hepatitis B virus HBV DNA levels and the management of HBV- infected health care workers”, Journal of viral hepatitis, (13), 2-4.
13. Brunetto MR,Moriconi F, Bonino F et al, (2010), “ Hepatitis B virus surface antigen leves: A guide to sustained response to PEG in HBeAg negative chronic hepatitis B”, Hepatology, (48), 700
14. R. Bartenschlager , C. Kuhn , H. Schaller , (1992), “ Expression of the p-protein of the human hepatitis B virus in a vaccinia virus system and detection of the nucleocapsid-associated p-gene product by radiolabelling at newly introduced phosphorylation sites”, Nucleic Acids Res, 195-202.
15. CJ.Chen , HI.Yang, J.Su et al, (2006), “Risk of hepatocellular carcinoma across a biological gradient of serum hepatitis B virus DNA level”. JAMA,295 (1): 65-73
16. Mary C.Kuhns, Steven H.Kleiman, Anne L.McNamara, (2004), “Lack of correlation between HBsAg and HBV DNA levels in blood donors who test positive for HBsAg and anti-HBc: Implication for future HBV screening policy”, Transfusion 2004, (44), 1332- 1339.
17. W.Cai, Q.Xie, X.Zhou et al, “On-treatment HBsAg serum level at 2 years: Strong predictor of sustained virologic response to Telbivudine for up to 2 years off-treatment in chronic hepatitis B patients”, AASLD 2009, 424.
18. X.Ding, M.Mizokami et al, (2001), “Hepatitis B virus genotype distribution among chronic hepatitis B virus carrier in shanghai”, China. J of intervirology, 43-47.
19. H.M. Elgouhari et al, (2008), “Hepatitis B infection: understanding its epidemiology, course and diagnosis” Cleve Clin J Med, (75), 881-9.
20. Ganji A., Esmaeilzadeh A, Ghafarzadegan K et al ,(2011), “ Correlation between HBsAg quantitative assay results and HBV-DNA levels in chronic HBV”, Hepat Mon, (5), 342-345
21. R.G.Gish, C.L.Lai et al, “Loss of HBsAg in Nucleoside-náve HbeAg (+) chronic hepatitis B patients following treatment with Entecavir or Lamivudine: Evaluation of genotype”, AASLD 2009, 388
22. WH.Gerlich, W. Luer, R.Thomssen et al, (1980), “Diagnosis of acute and inapparent hepatitis B virus infections by measurement of IgM antibody to hepatitis B core antigen”, J infect Dis, (142), 95-101.
23. Chan Henry Ly, (2011), “The clinical utility of HBV DNA and HBsAg quantification in Chronic Hepatitis B”, Conference papers Annual hepatitis III, Ha Noi, 19-44.
24. Chan Henry Ly, Y. Hui, NWY. Leung, (2000), “Risk factors for active liver disease in HbeAg-negative chronic hepatitis B virus-infected patients”, Am J. Gastroenterol, (95), 3547-3551
25. Hoofnagle, (1995), “Hepatitis B “, Gastroenterology, Chapter 108, (3), 2062 – 2069.
26. J.Hou, J.Sun, Q.Xie et al, “On-treatment quan-tification of HBsAg in difficult-to-treat patients with Lamivudine resistance can help identify those most likely to achieve sustained-post-treatment response to Peginterferon alfa 2a rescue therapy”, AASLD 2009, 392.
27. Norder.H, et al, (2004), “Genetic diversity of hepatitis B virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes and HBsAg subtypes”
Intervirology, (47), 289-309.
28. SJ.Hadziyannis, GV. Papatheodoridis, (2006), “Hepatitis B antigen- negative chronic hepatitis B: natural history and treatment”, Semin Liver Dis, (26), 130-141.
29. Jaroszewics Jerzy, Serrano Calle Beatriz, Kersten Wursthorn et al, (2010), “Hepatitis B surface antigen level in natural history of hepatitis B virus infection”, A European perspective.J.Hepatol, (4), 514-522.
30. Heermann K.H, U. Goldmann, W. Schwartz et al, (1984), “Large surface proteins of hepatitis B virus containing the pre-S sequence”,
J.Virol, (52), 396-402
31. JH.Kao, (2003), “Hepatitis B virus genotype and hepatocellular carcinoma in Taiwan”, J of intervirology, 400-407.
32. Kramvis et al, (2005), “Hepatitis B virus genotypes”, Vaccine, (23), 2409-23.
33. M.Kann, W.Gerlich, “Structure and molecular virology”, Viral hepatitis- endition Churchill Livinstone, section 3: Hepadnaviridae, (7), 77-105
34. Harry L.A.Janssen, Rudolf A.Heijtink et al, (1994), “Mesurement of HBsAg to monitor hepatitis B viral replication in patients on alfa interferon therapy”, Antiviral Research, (23), 251-257.
35. TA. Landers, HP. Greenberg, WS. Robinson, (1997), “Structure of hepatitis B Dane particle DNA and nature of endogenous DNA polymerase reaction”,
J.Virol, (23), 368-376.
36. Herve Mommeja-Martin, Elsa Mondou, Robert M Blum, (2003), “Serum HBV DNA as a marker of efficacy during therapy for chronic HBV infection: Analysis and review of the literature”, Hepatology, June
37. Martino Peignoux M, Moucari R, Leclere L, (2011), “ Quantitative HBsAg: a new specific marker for the diagnostic of HBsAg inactive”,
EASL 2011
38. Milne, DJ. West, DV. Chinh et al, (2003), “Role of hepatitis B immunoglobulin in infants born to hepatitis B e antigen-negative carrier mothers in Taiwan”, Pediatr Infect Dis J, (22), 584-588.
39. Rami Moucari, Vincent Mackiewiccz, Oliver Lada et al, “Early serum HBsAg drop: A strong predictor of sustained virological response to pegylated Interferon Alpha-2a in HbeAg negative patients”, Hepatology 2009, (49), 1151-1157.
40. H.Okamoto, F.Tsuda, Y.Akahane et al, (1994), “Hepatitis B virus with mutations in the core promoter for an antigen-negative phenotype in carriers with antibody to antigen”, J.Viro, (12), 8102-8110.
41. Jie Peng, Kangxian Luo et al, (2003), “Clinical and histological characteristics of chronic hepatitis B e- antigen”, Chinese medical journal, (9), 1312-1317.
42. M.Qiao, TB.Macnaughton, EJ.Gowans, (1994) “Adsortion and penetration of hepatitis B virus in a nonpermissive cell line”, Virology, 356-363.
43. G.Radziwill, W.Tucker, H.Schaller, (1990) “Mutational analysis of the hepatitis B virus p gene product: domain structure and Rnase H activity”, J. Virol, (64), 613-620.
44. Roche, (2011), “Measuring HBsAg in practice”, Conference papers Annual hepatitis III, Ha Noi, 45-53
45. Anna S.F. Lok, SJ. Hadziyannis, IVD. Weller et al, (1984), “Contribution of low level HBV replication to continuing inflammatory activity in patients with anti-Hbe positive chronic hepatitis B virus infection”, Gut, (25), 1283-1287
46. Anna S.F.Lok, Brian J. McMahon, (2009), “AASLD PRACTICE GUIDELINES.Chronic Hepatitis B: Update 2009”, HEPATOLOGY, September
47. C. Seeger, J. Summers, WS. Mason, (1991), “Viral DNA synthesis”,
Curr top Microbiol Immunol, (168), 41-60.
48. F.Saugauchi, E.Orito, Ichida et al, (2003), “Epidemiologic and virologic characteristics of hepatitis B virus genotype B having the recombination with genotype C”, Gas-troenterology, 925-932.
49. Ioannis S. Elefsiniotis, Irene Glynou et al, (2005), “HBeAg negative serological status and low viral replication levels characterize chronic hepatitis B virus-infected women at reproductive age in Gree: A one-year prospective single center study”, World Gastroenterol, (31), 4879-4882 50. JS. Tuttleman, JS. Pugh, JW. Summer, (1986) “In vitro experimental
infection of primary duck hepatocyte cultures with duck hepatitis B virus”, J. Virol, (58), 17-25
51. Nguyen Tin, Thompson.V.J Alexander, Scott Bowden et al, (2010), “Hepatitis B surface antigen levels during the natural history of chronic hepatitis B”, A perspective in Asia.J.Hepatol, (4), 508 – 513.
52. M.VanZonneveld, AB.van Nunen et al, (2003), “Lavumidine treatment during pregnancy to prevent perinatal transmission of hepatitis B virus infection”, J. Viral Hepat, (10), 294-297
53. C. Westland, WT.Delaney, H.Yang et al, (2003), “Hepatitis B virus genotypes and virologic response in 694 patients in phase III studies of adefovir dipivoxi”, Gastroenterology, (1), 107-116.
55. Yao Xie, Hui Zhao, Wang-Su Dai and Dao-Zhen Xu “HBV DNA level and concentration in evaluating liver damage of patients with chronic hepatitis B”, Hepatobiliary Pancreatic disease international, (3), 418-422. 56. Kim YJ., Hyun C., Cho et al, (2011), “The change of the quantitative
HBsAg level during the natural course of chronic hepatitis B”, Liver international, (31), 817-823.
57. G.H.Zacharakis, J.Koskinas, (2005), “Natural history of chronic HBV infection: A cohort study with up to 12 years follow-up in North Greece (part of the interreg I-II/EC-project)”, Journal of medical virology, (77), 173-179.
58. S.Zhong, W.Yeo, C.Schroder, P.K.S.Chan et al, (2004), “High hepatitis B virus HBV DNA viral load is an important risk factor for HBV reactivation in breast cancer patients undergoing cytotoxic chemotherapy”, Journal of Viral Hepatitis, (11), 55-99.
BỆNH ÁN NGHIấN CỨU
Đề tài:
Nghiờn cứu nồng độ HBsAg, HBV-DNA ở bệnh nhõn viờm gan B mĩn tớnh Mĩ số: ……… I. Hành chớnh Họ tờn bệnh nhõn: ……… Giới: …… Tuổi: ... Nghề nghiệp: ……… Tel: ... Địa chỉ: ... Ngày khỏm: ... II. Lý do khỏm bệnh: Mệt mỏi, ăn kộm 1. Cú 2. Khụng