6. Bố cục luận văn
2.2.Nội dung nghiên cứu
Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, thời gian, dung tỉ đến hiệu suất chiết tách.
Sử dụng phần mềm Design Expert 9 để tối ưu hóa hiệu suất chiết theo phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology, RSM)
Đánh giá khả năng chỉ thị pH thông qua sự thay đổi màu sắc của chất màu RC.
Chế tạo vật liệu cảm biến pH bằng cách nhuộm chất màu RC lên các vật liệu nền.
Sử dụng vật liệu cảm biến pH để nhận biết sự phân hủy của một số sản phẩm sữa.
2.3. Đối tƣợng, hóa chất và thiết bị 2.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Bắp cải tím Xuất xứ Đà Lạt được cung cấp bởi siêu thị VinMart,
Việt Nam.
Màng xơ xenlulo (Giấy lọc)
Macherey-Nagel GmbH & Co.KG. Germany.
Xenlophan Xuất xứ hàng Merck.
Hyđrogel PCA 23-30 Vật liệu được tổng hợp bởi TS. Nguyễn Ngọc Thắng
[33] (Xem phần phụ lục).
Sữa đậu nành Mua tại chợ truyền thống.
2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm được trình bày ở bảng 2.1.
STT Tên hóa chất Công thức hóa học Xuất xứ
1 Etanol CH3CH2OH Trung quốc
2 Axit formic HCOOH Trung quốc
3 Amoni hydroxit NH4OH Trung quốc
4 Axit clohydric HCl Trung quốc
5 Kali clorua KCl Trung quốc
6 Kali hydrophtalat KHC8H4O4 Trung quốc
7 Natri hydroxit NaOH Trung quốc
8 Kali dihydro photphat KH2PO4 Trung quốc
9 Kali hydro photphat K2HPO4 Trung quốc
10 Natri hydro cacbonat NaHCO3 Trung quốc
11 Borax Na2B4O7.10H2O Trung quốc
2.3.3. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Máy xay Philips HR2100.
Bể rửa siêu âm: Elmasonic - S70H. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Máy đo mật độ quang phổ UV-VIS (Unico 4802 Double Beam Uv/Vis Spectrophotometer).
Micropipet - BIOHT, dung tích 5-50µ.
Máy sấy chân không (Vaccum oven ADP 300).
Máy cất quay chân không - Hãng BUCHI.
Máy nhuộm BATHS HH-S6.
Một số dụng cụ khác như: ống nghiệm, giấy lọc, cuvet, cốc thủy tinh...
Hình 2.1. Hình ảnh đối tượng nghiên cứu và hóa chất sử dụng.
Bắp cải tím Màng xơ xenlulo Xenlophan
PCA 23-30 Sữa đậu nành Etanol
Amoniac Sữa bò tươi
Micropipet Máy sấy
Hình 2.2. Hình ảnh dụng cụ và thiết bị thí nghiệm.
S70H Elmasonic
Máy nhuộm BATHS HH-S 6
Unico 4802 Double Beam Uv/Vis Spectrophotometer
Máy cất quay chân không
Máy đo độ pH Cân khối lượng
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp chiết tách chất màu
Chất màu từ bắp cải tím được chiết tách theo hai dạng là chiết trong dung môi (dung môi etanol được axit hóa bởi axit formic) và chiết trong nước để đối chứng rằng chất màu thu được khi chiết trong dung môi không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố hóa chất, nhiệt độ...
Chiết trong nước (Antho-Aq)
Nguyên liệu bắp cải tím được làm sạch, cắt lát và nghiền nhỏ bằng máy xay Philips HR2100. Lấy một lượng khoảng 40g bắp cải tím đã nghiền, chiết lọc lấy dung dịch chất màu. Bảo quản trong tủ lạnh cho quá trình nhuộm màu lên vật liệu.
Chiết trong dung môi (Antho-a)
Nguyên liệu bắp cải tím được làm sạch, cắt lát và nghiền nhỏ bằng máy xay Philips HR2100. Cân lượng xác định bắp cải tím đã nghiền (4.0 g) và tiến hành chiết tách chất màu với 20 ml dung môi etanol đã axit hóa bằng axit fomic 1%, trong bể rửa siêu âm công suất 750W (S70H Elmasonic, Đức). Điều kiện chiết bao gồm nhiệt độ, thời gian và nồng độ etanol được trình bày trong bảng 2.2. Sau khi chiết, dung dịch chất màu được phân tách qua giấy lọc. Một phần dung dịch chiết được đo mật độ quang bằng thiết bị Unico 4802 Double Beam UV/Vis Spectrophotometer để xác định giá trị độ hấp thụ và tìm điều kiện tối ưu. Chiết tách lượng lớn ở điều kiện tối ưu, cất ngay chân không (Buchi Rotavapor R-210) để thu được dung dịch ở dạng cô đặc sau đó trung hòa và bảo quản để sử dụng cho quá trình nhuộm màu lên các vật liệu nền. Quy trình chiết tách chất màu từ bắp cải tím và nhuộm màu cho vật liệu được trình bày trong hình 2.3.
2.4.2. Phƣơng pháp đánh giá và định lƣợng chất màu
Sử dụng phương pháp pH vi sai để xác định hàm lượng anthocyanin. Đây là một phương pháp cho phép xác định hàm lượng anthocyanin trong hỗn hợp chứa anthocyanin không tinh khiết một cách đơn giản, nhanh chóng, chính xác mà hầu hết các công trình nghiên cứu về chiết tách anthocyanin từ thực vật đều dùng phương pháp này để định lượng anthocyanin.
Nguyên tắc của phương pháp: dựa trên sự thay đổi màu và thay đổi độ hấp thụ của anthocyanin theo sự thay đổi của pH. Tại pH = 1, anthocyanin có màu và độ hấp thụ cực đại, tại pH = 4,5 anthocyanin không màu và có độ hấp thụ gần như bằng không.
Nghiền
Dịch chiết Đo UV-Vis
Chiết siêu âm Etanol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung dịch cô đặc Cất quay chân không
Chiết mẫu lớn Chiết trong nƣớc
Nhuộm
Lấy một lượng nhỏ chất màu sau chiết đem đi xác định giá trị độ hấp thụ của anthocyanin bằng thiết bị đo quang phổ hấp thụ phân tử UV- Vis. Sử dụng hai dung dịch đệm có pH =1 (KCl + HCl) và pH = 4,5 (KHC8H4O4 + HCl). Độ hấp thụ của anthocyanin trong dịch chiết được xác định ở bước sóng 520 nm và 700 nm. Trong đó, mỗi ống cuvet chứa 2ml dung dịch đệm và 500μl dịch màu chiết, được lấy chuẩn bằng micropipet. Hàm lượng anthocyanin có trong dịch chiết bắp cải tím được quy đổi theo mg C3G/l dịch chiết và tính theo công thức (1) [34].
Ta = A×M×DF×1000/(ε×L), mg/l (1) Trong đó:
A= (Aλmax. pH=1 – A700nm. pH=1) - (Aλmax. pH= 4,5 – A700nm. pH= 4,5)
M: khối lượng phân tử của C3G, g/mol
DF: hệ số pha loãng
ε = 26900: hệ số hấp thụ phân tử, mol-1.cm-1
L: chiều dày cuvet, 1 cm
2.4.3. Lập kế hoạch thực nghiệm
Các thí nghiệm được thiết kế theo mô hình BoxBehnken (BBD- Box-Behnken Design) với ba biến số độc lập (nhiệt độ, thời gian và nồng độ etanol) và hàm mục tiêu là hàm lượng chất màu anthocyanin. Mỗi biến số tiến hành tại 3 mức (-1, 0, +1) được trình bày trong bảng 2.2. Các thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Tính toán độ tin cậy của số liệu, phân tích ANOVA, tìm phương trình hồi quy bằng phần mềm Design Expert 10. Phương trình hồi quy có dạng:
Y = β0 + β1X1 + β2X2 + β3X3 + β11X1X1 + β22X2X2
+ β33X3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 (2)
Trong đó: Y: Hàm mục tiêu
Xi: Giá trị mã hóa của yếu tố thứ i βi: Hệ số hồi quy
Biến nghiên cứu Đơn vị Mã hóa Giá trị
-1 0 +1
Nhiệt độ (A) °C X1 35 50 65
Thời gian (B) phút X2 5 25 45
Nồng độ etanol (C) % X3 10 45 80
2.5. Phƣơng pháp nhuộm màu cho các vật liệu nền 2.5.1. Nhuộm màu cho xenlophan
a) Nhuộm màu cho xenlophan tại các điều kiện nhuộm khác nhau bằng dung dịch anthocyanin chiết trong dung môi ( Xelo/Antho-a)
Chuẩn bị dung dịch nhuộm
Dung dịch thu được sau chiết tách được cô đặc bằng máy cất quay chân không. Tính toán giá trị nồng độ chất màu anhthocyanin theo công thức (1) thu được nồng độ chất màu là 1,75 mol/l. Pha loãng dung dịch chất màu để đạt nồng độ 1,5mol/l. Sau đó trung hòa bằng dung dịch NH4OH. Vì xenlophan có nguồn gốc từ xenlulo nên được nhuộm tốt trong môi trường kiềm. Tuy nhiên trong môi trường kiềm ở nhiệt độ cao chất màu anthocyanin có thể bị phá hủy nên tác giả sử dụng dung dịch NH4OH để tạo môi trường kiềm có pH=8-9 cho dung dịch nhuộm.
Đơn công nghệ
Khối lượng xenlophan 0,2 (g)
Dung tỷ 30/1 (ml/g)
1. NH
4OH pH = 8-9 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Dung dịch chất màu anthocyanin C
Antho = 1,5mol/l
Điều kiện nhuộm
Nhiệt độ: t1, t2, t3 = 60, 80, 100 (ºC)
Thời gian: T2 – T1 = 4, 6, 8 (giờ)
Điều kiện sấy
Thời gian: 60 phút Nhiệt độ: 50ºC
Tổng số 9 thí nghiệm được thực hiện cho quá trình nhuộm. Vật liệu nhuộm sau khi sấy khô được đo mật độ quang bằng thiết bị UV-Vis để xác định giá trị độ hấp thụ màu trên vật liệu và tìm điều kiện nhuộm tối ưu. Sau đó tiến hành nhuộm cho các vật liệu nền khác.
b) Nhuộm màu cho xenlophan bằng dung dịch anthocyanin chiết trong môi trƣờng nƣớc (Xelo/Antho-Aq)
Đơn công nghệ
Khối lượng xenlophan 0,2 (g)
Dung tỷ 30/1 (ml/g)
1. Dung dịch chất màu anthocyanin NA
Điều kiện nhuộm
Nhiệt độ: 80°C Thời gian: 6 (giờ)
Điều kiện sấy
Nhiệt độ: 50ºC Thời gian: 60 phút
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình nhuộm Xelo/Antho-a.
2.5.2. Nhuộm màu cho màng xơ xenlulo
a) Nhuộm màu cho màng xơ xenlulo bằng dung dịch anthocyanin chiết trong dung môi (Xel/Antho-a)
Đơn công nghệ
Khối lượng xenlulo 0,5 (g)
Dung tỷ 30/1 (ml/g)
1. NH
4OH pH = 8-9
2. Dung dịch chất màu anthocyanin C
Antho = 1,5mol/l
Điều kiện nhuộm
Nhiệt độ: 80°C Thời gian: 30 phút
Điều kiện sấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhiệt độ: 50ºC Thời gian: 60 phút
b) Nhuộm màu cho màng xơ xenlulo bằng dung dịch anthocyanin chiết trong môi trƣờng nƣớc (Xel/Antho-Aq)
Đơn công nghệ
Khối lượng xenlulo 0,5 (g)
Dung tỷ 30/1 (ml/g)
1. Dung dịch chất màu anthocyanin NA
Điều kiện nhuộm
Nhiệt độ: 80°C Thời gian: 30 phút
Điều kiện sấy
Nhiệt độ: 50°C Thời gian: 60 phút
2.5.3. Nhuộm màu cho vật liệu hyđrogel PCA23-30
a) Nhuộm màu cho vật liệu hyđrogel PCA23-30 bằng dung dịch anthocyanin chiết trong dung môi (Hyđrogel/Antho-a)
Đơn công nghệ
Khối lượng hyđrogel PCA23-30 1 g
Dung tỷ 30/1 (ml/g)
Dung dịch chất màu anthocyanin C
Antho = 1,5mol/l
Điều kiện nhuộm
Nhiệt độ phòng: 25ºC Thời gian: 30 phút
Điều kiện sấy
Nhiệt độ: 50°C Thời gian: 60 phút
b) Nhuộm màu cho vật liệu hyđrogel PCA23-30 bằng dung dịch anthocyanin chiết trong môi trƣờng nƣớc (Hyđrogel/Antho-Aq)
Đơn công nghệ
Khối lượng hyđrogel PCA23-30 1 g
Dung tỷ 30/1 (ml/g)
Dung dịch chất màu anthocyanin NA
Điều kiện nhuộm
Nhiệt độ phòng: 25ºC Thời gian: 30 phút
Điều kiện sấy
Nhiệt độ: 50°C Thời gian: 60 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.6. Phƣơng pháp khảo sát khả năng chỉ thị màu của anthocyanin theo pH
Khảo sát sự thay đổi màu của dung dịch chất màu anthocyanin và sự thay đổi màu của vật liệu nhuộm màu anhocyanin tại các điều kiện pH khác nhau, từ đó chứng minh khả năng chỉ thị màu của anthocyanin theo pH.
2.6.1. Phƣơng pháp khảo sát khả năng chỉ thị màu của dung dịch chất màu anthocyanin chiết trong dung môi (Antho-a) theo pH
Khảo sát sự đổi màu của antho-a tại các điều kiện pH thay đổi trong khoảng pH = 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13.
Dung dịch antho-a chiết tại điều kiện tối ưu được cô đặc sau đó trung hòa bằng NH4OH.
Cho dịch chiết sau khi trung hòa vào từng đĩa Petri (đường kính 50mm) chứa dung dịch pH khác nhau như hình 2.8 với tỷ lệ dung dịch chất màu anthocyanin trong dung dịch pH là 1/6 (ở tỷ lệ này ta dễ dàng quan sát sự đổi màu bằng mắt).
Tiến hành quan sát dãy màu bằng mắt thường, ghi nhận kết quả, sau đó đo quang phổ hấp thụ của từng dung dịch trong các đĩa Petri ở trên.
Quy trình thí nghiệm được bố trí như sau:
2.6.2. Phƣơng pháp khảo sát khả năng chỉ thị màu của vật liệu nhuộm màu anthocyanin theo pH
Quy trình thí nghiệm:
Khảo sát sự đổi màu của vật liệu nhuộm màu anthocyanin trong các điều kiện dung dịch pH = 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13.
Hình 2.8. Quy trình khảo sát sự thay đổi màu của dung dịch anthocyanin theo pH.
Hình 2.9. Quy trình khảo sát sự thay đổi màu của vật liệu nhuộm màu anthocyanin theo pH.
Các vật liệu đã được nhuộm màu anthocyanin kích thước 1x1 cm lần lượt được đặt vào trong từng đĩa Petri chứa 3ml dung dịch pH khác nhau bố trí như hình 2.9.
Quan sát sự thay đổi màu của vật liệu nhuộm trong các dung dịch pH khác nhau.
2.7. Khảo sát khả năng ứng dụng chất màu anthocyanin để nhận biết sự phân hủy theo thời gian của một số sản phẩm sữa hủy theo thời gian của một số sản phẩm sữa
Trong nghiên cứu này, khảo sát khả năng nhận biết sự phân hủy theo thời gian của sữa đậu nành và sữa bò Vinamilk bằng dung dịch chất màu anthocyanin và các vật liệu nhuộm màu anthocyanin.
Sữa đậu nành các tại thời điểm:
- Sữa mới mua. - Sữa sau 6 giờ. - Sữa sau 8 giờ.
Sữa bò Vinamilk tại các thời điểm:
- Còn hạn sử dụng.
- Hết hạn sử dụng 1 tháng.
Sơ đồ quy trình thí nghiệm được trình bày ở hình 2.10
Nhận biết sự phân hủy của sữa bằng dung dịch chất màu anthocyanin
Lấy 0,5ml chất màu nhỏ vào 3ml sữa trong đĩa Petri ở các thời điểm khảo sát nói trên, quan sát sự thay đổi màu của chất màu trong sữa.
Nhận biết sự phân hủy của sữa bằng vật liệu nhuộm màu.
Hình 2.10. Sơ đồ quy trình khảo sát khả năng nhận biết sự phân hủy của sữa bằng chất màu anthocyanin.
Các vật liệu nhuộm màu được cắt thành miếng kích thước 1x1 cm, thả vào 3ml dung dịch sữa trong đĩa Petri ở mỗi khoảng thời gian khảo sát như trên. Quan sát sự thay đổi màu của vật liệu nhuộm màu.
Sử dụng giấy pH thương mại so sánh khả năng chỉ thị của anthocyanin.
Giấy chỉ thị pH được thử với 2 loại sữa tại các thời điểm khảo sát như trên, quan sát sự thay đổi màu của giấy pH để đối chứng khả năng nhận biết sự phân hủy của sữa của vật liệu nhuộm màu anthocyanin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá định lƣợng chất màu anthocyanin
Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis của dung dịch chất màu chiết tách từ bắp cải tím tại điều kiện chiết nhiệt độ 63,45°C, thời gian 34,44 phút, nồng độ 10,14%. Từ phổ hình 3.1 ta thấy, anthocyanin có bước sóng hấp thụ cực đại là 522 nm. Kết quả này phù hợp với độ hấp thụ cực đại các anthocyanin trong khoảng bước sóng 510 - 540 nm và nó cũng phù hợp với kết quả xác định bước sóng cực đại của bắp cải tím đã công bố [35].
.
Hình 3.1. Phổ UV-Vis của chất màu anthocyanin chiết từ bắp cải tím.
3.2. Quy hoạch thực nghiệm
Áp dụng mô hình Box-Behnken (BBD) để thiết kế các thí nghiệm với sự trợ giúp của phần mềm DX10, 18 thí nghiệm đã được thực hiện, mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần, kết quả của độ hấp thụ cực đại và hàm lượng anthocyanin được trình bày trong bảng 3.1. STT Nhiệt độ (°C) Thời gian (phút) Nồng độ etanol (ml/g) Độ hấp thụ (A) Hàm hƣợng anthocyanin (Ta mg/l) 1 50 25 45 0,753 62,871 2 65 5 45 0,838 69,968 3 50 25 45 0,753 62,871 4 65 45 45 0,884 73,809 5 65 25 10 0.893 74,651 6 50 25 45 0,735 62,871 7 35 25 10 0,809 67,547 8 50 45 10 0,869 72,557 9 50 45 80 0,867 72,390 10 35 5 45 0,835 71,221 11 50 25 45 0,735 62,871 12 35 25 80 0,832 69,467 13 50 25 45 0,735 62,871 14 50 5 10 0,864 72,139 15 65 25 80 0,819 68,382 16 35 45 45 0,835 69,718 17 50 25 45 0,735 62,871 18 50 5 80 0,854 71,304
Sử dụng phần mềm DX10 để xử lý và phân tích kết quả thực nghiệm tác giả nhận được mô hình phù hợp nhất để biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng anthocyanin và các biến thực nghiệm là mô hình hồi quy bậc hai do có các hệ số xác định cao. Giá trị hệ số R2
xác định và R2hiệu chỉnh đối với hàm lượng anthocyanin lần
Bảng 3.1. Bảng ma trận mã hóa theo mô hình BBD và kết quả
lượt là 99,19% và 98,27% (bảng 3.2 ). Hệ số xác định cho biết có 99,19% sự biến thiên của hàm lượng anthocyanin chiết được là do tác động của các biến độc lập như nhiệt độ chiết, thời gian siêu âm và nồng độ etanol, và chỉ có 0,81% là do các yếu tố bên ngoài không xác định bởi mô hình gây ra (sai số ngẫu nhiên).
Nguồn Hàm lƣợng anthocyanin SS DF MS F P Mô hình 7,82 9 0,87 40,21 <0,0001 X1 9,61 1 9,16 29,50 0,0006 X2 1,84 1 1,84 5,66 0,0446