2. Đề tài: THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT
2.4.2.3 lặp lại (repeatability)
Độ lặp lại (hay độ chính xác) là mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng lẻ với giá trị trung bình x thu đƣợc khi áp dụng phƣơng pháp đề xuất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện xác định.
Độ lặp lại bị ảnh hƣởng bởi sai số ngẫu nhiên .
Kết quả định lƣợng mẫu giả định – Kết quả định lƣợng mẫu trắng
H% = 100% - 100% Kết quả định lƣợng mẫu giả định
Độ lặp lại thƣờng đƣợc thể hiện bằng độ lệch chuẩn (SD) hay độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) của một loạt các lần thử ngiệm.
Cách thực hiện:
Với cùng một mẫu đƣợc làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phƣơng pháp đề xuất n lần (n = 6 – 10 hay nhiều hơn). Sau đó áp dụng công thức tính SD và RSD của phƣơng pháp.
Yêu cầu: RSD càng nhỏ, phƣơng pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiệm đƣa ra. Thông thƣờng ta chọn RSD ≤ 2%
SD= 2 1 n X xi X: giá trị trung bình RSD= 100% X SD X= n xi 2.4.2.4. Độ đúng (accuracy)
Độ đúng của một phƣơng pháp phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã đƣợc làm đồng nhất trong điều kiện xác định.
Đại lƣợng đặc trƣng cho độ đúng: BIAS, tỉ lệ phục hồi.
BIAS: là hiệu giữa hàm lƣợng thêm vào và hàm lƣợng tìm lại đƣợc bằng quy trình. Độ đúng biểu thị bằng tỉ lệ % phục hồi của giá trị thêm vào mẫu thử bằng phƣơng pháp xây dựng.
Cách thực hiện:
Xác định hàm lƣợng của chất cần thử trong mẫu đem thử bằng phƣơng pháp dự kiến.
Cho vào mẫu thử một lƣợng chất chuẩn của chất cần thử có hàm lƣợng bằng 80%, 100%, 120% so với hàm lƣợng chất đó có trong mẫu thử, rồi tiến hành xác định bằng phƣơng pháp đề xuất.
Cách tính độ đúng Hàm lƣợng tìm lại là: µ
Hàm lƣợng chuẩn thêm vào là: x
Tỉ lệ phục hồi (Đ) = 100%
x
2.4.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD) (limit of detection)
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất thử trong mẫu thử còn có thể phát hiện bằng phƣơng pháp đề xuất, nó là một thông số của phƣơng pháp thử giới hạn.
Giới hạn phát hiện thƣờng đƣợc biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần tỷ của chất cần thử trong mẫu. Việc xác định giới hạn phát hiện không cần thiết phải định lƣợng chính xác mà chỉ cần xác định chất thử có nồng độ thấp hơn hay cao hơn một giới hạn nào đó.
Xác định: giới hạn phát hiện đƣợc xác định dựa vào phƣơng trình hồi quy tuyến tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F-phân phối Fischer và trắc nghiệm t-phân phối Student).
Giới hạn phát hiện (Limit of Detection = LOD) đƣợc tính theo công thức:
LOD = 3,3*độ lệch chuẩn/độ dốc
2.4.2.6 Giới hạn định lƣợng (LOQ) (limit of quantition)
Giới hạn định lƣợng là một thông số của phƣơng pháp phân tích định lƣợng các hợp chất có trong một khung mẫu với lƣợng thấp nhƣ những tạp chất trong nguyên liệu làm thuốc và sản phẩm phân hủy có trong chế phẩm. Giới hạn định lƣợng là nồng độ thấp nhất của chất cần phân tích có trong một mẫu thí nghiệm còn có thể xác định đƣợc với độ đúng và độ chính xác có thể chấp nhận đƣợc.
Giới hạn định lƣợng có thể đƣợc biểu thị bằng nồng độ phần trăm, phần ngàn, phần tỷ có chất cần phân tích có trong mẫu.
Xác định: giới hạn định lƣợng đƣợc xác định dựa vào phƣơng trình hồi quy tuyến
tính của mẫu thử và các thông số thống kê (trắc nghiệm F-phân phối Fischer và trắc nghiệm t-phân phối Student).
Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation = LOQ) đƣợc tính theo công thức:
CHƢƠNG 3. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U
3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN
3.1.1 Địa điểm thực hiện
- Địa điểm: Phòng Kiểm Nghiệm – Công ty cổ phần Dƣợc Hậu Giang.
- Địa chỉ: 288 Biss - Nguyễn Văn Cừ - Quận Ninh Kiều - Thành phố Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian thực hiện
Từ ngày 14/02/2011 đến ngày 14/04/2011.
3.2 PHƢƠNG TIỆN THỰC HIỆN
3.2.1 Thiết bị và dụng cụ
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Merck-Hitachi
- Cân điện tử AB204-S của Mettler Toledo (cấp chính xác I) - Bể siêu âm hòa tan Branson.
- Thiết bị lọc áp suất thấp.
- Bình định mức, pipet, đạt cấp chính xác loại A.
Hình 3.3: Bể siêu âm hòa tan Branson Hình 3.4: Pipet chính xác 10 ml và bình định mức 100 ml, 50 ml
3.2.2 Chuẩn bị hóa chất, dung môi
- Nƣớc siêu sạch
- Acetonitril (hãng Merck)
- Dung dịch methanol (hãng Merck) - Dung dịch pH 3,0
♣ Cách pha dung dịch đệm pH 3,0: Hòa tan 7 mL Triethylamin trong 1000 mL nƣớc cất, chỉnh về pH = 3,0 ± 0,1 với H3PO4 đậm đặc.
3.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Chất chuẩn đối chiếu: Amlodipin besilat, số lô: QT145051110, hàm lƣợng: 99,4%, nơi sản xuất: Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh.
- Mẫu thử: Viên nang Apitim 5 do Công ty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang sản xuất với 3 lô: 041210, 010111, 030111.
3.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thực hiện theo Dƣợc Điển Việt Nam 4 (DĐVN 4), trang 46
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (15 cm x 3,9 mm) đƣợc nhồi bằng pha tĩnh C (5 μm)
Pha động: Acetonitril – Methanol – Dung dịch pH 3,0 (15 : 35 : 50 )
Detector quang phổ tử ngoại (UV – Vis) đặt ở bƣớc sóng : 237 nm
Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút
Thể tích tiêm: 10 μL
Tiến hành:
Dùng pha động hòa tan M (g) mẫu chuẩn và mẫu thử. Sau đó pha loãng thành V1 mL với cùng pha động. Hút chính xác V mL dung dịch thu đƣợc, pha loãng thành V2 mL bằng pha động.
Tiến hành sắc ký với dung dịch thử và dung dịch đối chiếu.
Tính hàm lƣợng của C20H25ClN2O5.C6H6O3S dựa vào diện tích peak đáp ứng của dung dịch thử và dung dịch chuẩn và hàm lƣợng đƣợc công bố của C20H25ClN2O5.C6H6O3S trong Amlodipin besilat chuẩn.
3.5 HOẠCH ĐỊNH THÍ NGHIỆM
3.5.1 Thẩm định quy trình định lƣợng Amlodipin besilat bằng HPLC HPLC
Thí nghiệm 1: Khảo sát tính phù hợp hệ thống (HPLC)
Thí nghiệm 2: Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ Amlodipin bằng HPLC Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đặc hiệu của Amlodipin bằng HPLC
Thí nghiệm 4: Khảo sát độ lặp lại của Amlodipin bằng HPLC Thí nghiệm 5: Khảo sát độ đúng của Amlodipin bằng HPLC
3.5.2 Áp dụng định tính và định lƣợng Amlodipin trong viên nang Apitim 5 ở 3 lô bằng HPLC
Thí nghiệm: Áp dụng phƣơng pháp để định lƣợng Amlodipin trong viên nang Apitim 5 ở 3 lô do Cty Cổ phần Dƣợc Hậu Giang sản xuất.
CHƢƠNG 4. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tính phù hợp hệ thống (HPLC)
4.1.1 Mục đích
Khảo sát RSD của các thông số: diện tích peak, thời gian lƣu, số đĩa lý thuyết, tính bất đối xứng của máy HPLC.
4.1.2 Thực hiện
Pha chế dung dịch chuẩn:
Cân khoảng 69 mg (cân thực là 69,5 mg) Amlodipin besilat chuẩn, cho vào bình định mức 100 mL, hòa tan và thêm vừa đủ bằng pha động (dung dịch 1).
Hút chính xác 5 mL dung dich 1 vào bình định mức 50 mL, thêm pha động vừa đủ. Lọc qua giấy lọc 0,45µm, đƣợc dung dịch chuẩn (dung dịch 2).
Sau khi máy chạy ổn định, tiêm dung dịch chuẩn 6 lần liên tiếp vào máy.
4.1.3. Kết quả
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của mẫu chuẩn Amlodiopin (HPLC) STT S TR N As 1 6899443 8,980 5136 1,37388 2 6909093 8,967 5127 1,37655 3 6914633 8,967 5125 1,36510 4 6915718 8,953 5119 1,38412 5 6923665 8,953 5120 1,38213 6 6931671 8,953 5112 1,38397 Trung bình 6915703,8 8,962 5123,167 1,378 RSD% 0,162 0,124 0,160 0,539
Trong đó:
S: diện tích peak Amlodipin TR: thời gian lƣu (phút) N: số đĩa lý thuyết As: tính bất đối xứng
Nhận xét:
Các thông số đặc trƣng của peak Amlodipin đều có RSD% ≤ 2%. Vậy hệ thống có tính phù hợp.
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khoảng tuyến tính tuyến của nồng độ Amlodipin bằng phƣơng pháp HPLC
4.2.1 Mục đích
- Khảo sát tính tuyến tính của dãy chuẩn: 40%, 60%, 80%, 100%, 120%, 140% so với nồng độ chuẩn định lƣợng.
- Xác định phƣơng trình hồi quy y = ax + b và hệ số tƣơng quan tuyến tính (R) giữa nồng độ và diện tích peak Amlodipin.
4.2.2 Thực hiện
Chuẩn bị mẫu: Cân khoảng 69 mg Amlodipin besilat chuẩn (cân thực là 69,2 mg) dùng làm chuẩn, cho vào bình định mức 100 mL. Thêm khoảng 60 mL dung dịch pha động, lắc kỹ và cho vào bể siêu âm khoảng 5 phút, sau đó cho thêm pha động vừa đủ, lắc đều (dung dịch S). Lấy từng thể tích dung dịch S bằng buret 10 mL cho lần lƣợt vào bình định mức 50 mL, thêm pha động vừa đủ theo bảng 4.2.
Bảng 4.2: Chuẩn bị mẫu khảo sát tính tuyến tính của Amlodipin STT Nồng độ Amlodipin (%) Nồng độ Amlodipin (g/ml) Dung dịch S (ml) Thể tích vừa đủ (ml) 1 40 20 2 50 2 60 30 3 50 3 80 40 4 50 4 100 50 5 50 5 120 60 6 50 6 140 70 7 50
Sau khi máy chạy ổn định, tiêm lặp lại 2 lần liên tiếp ở mỗi nồng độ vào máy sắc ký.
4.2.3. Kết quả
Bảng 4.3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ Amlodipin
Nhận xét:
Trắc nghiệm thống kê:[5]
Trắc nghiệm t (phân phối Student): tα = TINV(0.05,1) = 12,7062 > to = - 1,13458219
tα = TINV(0.05,4) = 2,776 < to = 110,1236538 Vậy hệ số (bo= - 67425) hay tung độ gốc không có ý nghĩa, hệ số (b = 135966) hay độ dốc có ý nghĩa.
Trắc nghiệm F (phân phối Fischer): Fα = FINV(0.05,1,4) = 7,7086 < F = 12127,21913
Phƣơng trình hồi quy tƣơng thích. Và R= 2
R = 0,99985
Vậy trong khoảng nồng độ: 20 – 70 g/mL thì nồng độ X và diện tích peak Y hoàn toàn tuyến tính.
*Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của Amlodipin:
Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính Y = 135966x – 67425, tính đƣợc giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp theo bảng 4.4.
X (Nồng độ) (g/ml) Y1(DT Peak 1) Y2(DT Peak 2) YTB(DT Peak TB) 20 2664165 2676386 2670275,5 30 3989615 4006645 3998130,0 40 5356498 5336520 5346509,0 50 6713621 6698912 6706266,5 60 8162556 8189036 8175796,0 70 9476386 9342337 9409361,5
Khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ X (g/ml) và diện tích peak trung bình YTB
Hình 4.1:Đƣờng tuyến tính và phƣơng trình hồi quy của Amlodipin
TUYẾN TÍNH AMLODIPINy = 135966x - 67425 R2 = 0.9997 0.0 2000000.0 4000000.0 6000000.0 8000000.0 10000000.0 0 20 40 60 80 x Nồng độ (mcg/ml) Y ( D iệ n t íc h p e a k )
Bảng 4.4:Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp
Phƣơng trình hồi quy Giới hạn phát hiện Giới hạn định lƣợng
Y= 135966x - 67425 LOD=3,3*độ lệch chuẩn/độ dốc =3,3*51649,90336/135966 = 1,254 (g/mL) LOQ=10*độ lệch chuẩn/độ dốc =10*51649,90336/135966 = 3,799 (g/mL)
(*) Độ lệch chuẩn = Standard Error (Phụ lục 4)
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tính đặc hiệu của Amlodipin bằng phƣơng pháp HPLC phƣơng pháp HPLC
4.3.1 Mục đích
Xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích (Amlodipin) và không ảnh hƣởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử.
4.3.2 Thực hiện
Chuẩn bị mẫu chuẩn Amlodipin besilat, mẫu thử, mẫu trắng.
Triển khai các mẫu trên sắc ký lỏng hiệu năng cao theo điều kiện đã chọn. Quan sát sắc ký đồ và nhận xét. 4.3.3 Kết quả Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 mAU 0 25 50 75 100 mAU 0 25 50 75 100 1.713 Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 mAU 0 25 50 75 100 mAU 0 25 50 75 100 1.707 9.383 Amlodipin B esilat Hình 4.2: Sắc ký đồ mẫu trắng khảo sát tính đặc hiệu (HPLC)
Hình 4.3: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Amlodipin khảo sát tính đặc hiệu (HPLC)
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 mAU 0 25 50 75 100 mAU 0 25 50 75 100 1.710 9.280 Amlodipin B esilat
Hình 4.4: Sắc ký đồ mẫu thử Amlodipin khảo sát tính đặc hiệu (HPLC)
Bảng 4.5: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của Amlodipin
STT Mẫu Lƣợng cân (mg) TR (phút) S Hàm lƣợng Amlodipin (%) 1 Mẫu trắng 914,0 0 0 0 2 Thử đặc hiệu 948,5 9,280 6858390 102,0 3 Chuẩn đặc hiệu 69,5 9,383 6697414 100,0 H%=100% - 100% 102 0 102 = 0 Nhận xét:
Từ kết quả của hình 4.2, hình 4.3, hình 4.4 và bảng 4.5 cho thấy mẫu trắng không có peak xuất hiện tại thời gian lƣu của mẫu thử và chuẩn và H% = 0. Nhƣ vậy, phƣơng pháp có tính đặc hiệu.
4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát độ lặp lại của Amlodipin bằng phƣơng pháp HPLC phƣơng pháp HPLC
4.4.1 Mục đích
4.4.2 Thực hiện
Dung dịch chuẩn:
- Cân khoảng 69 mg (cân thực là 69,5 mg) Amlodipin besilat chuẩn, cho vào bình định mức 100 mL, hòa tan và thêm vừa đủ bằng pha động (dung dịch 1).
- Hút chính xác 5 mL dung dich 1 vào bình định mức 50 mL, thêm pha động vừa đủ. Lọc qua giấy lọc 0,45µm, đƣợc dung dịch chuẩn (dung dịch 2).
Dung dịch thử: (Cân trên cùng một chế phẩm 6 mẫu thử). Cân chính xác khoảng một lƣợng bột viên tƣơng ứng với 25 mg Amlodipin cho vào bình định mức 100 mL. Thêm khoảng 60 mL dung dịch pha động, lắc kỹ và cho vào bể siêu âm khoảng 5 phút, sau đó cho thêm pha động vừa đủ, lắc đều. Lọc bỏ 30 mL dịch lọc đầu. Hút chính xác 10 mL dung dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL, thêm pha động vừa đủ, lắc đều. Lọc qua giấy lọc 0,45 μm.
Tiến hành chạy mẫu:
Sau khi máy chạy ổn định, tiêm mẫu chuẩn và mẫu thử vào máy sắc ký và tính toán kết quả theo công thức:
Hàm lƣợng phần trăm (%) hoạt chất trong mỗi viên đƣợc tính theo công thức:
X (%)= 5 100 1 , 567 9 , 408 % 2 m P C a R R c t Trong đó:
Rt: Diện tích peak Amlodipin besilat có trong sắc ký đồ dung dịch thử. Rc: Diện tích peak Amlodipin besilat có trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn. a: Lƣợng cân của chuẩn Amlodipin besilat (mg).
C%: Hàm lƣợng phần trăm của chuẩn Amlodipin besilat (%). P: Khối lƣợng trung bình bột thuốc trong nang (mg).
m: Lƣợng cân mẫu thử (mg).
408,9 : Phân tử lƣợng của Amlodipin.
567,1: Phân tử lƣợng của Amlodipin besilat.
Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 mAU 0 25 50 75 100 mAU 0 25 50 75 100 1.703 8.953 Amlodipin B esilat Minutes 0 2 4 6 8 10 12 14 mAU 0 25 50 75 100 mAU 0 25 50 75 100 1.703 8.957 Amlodipin B esilat
Hình 4.5: Sắc ký đồ mẫu chuẩn Amlodipin khảo sát độ lặp lại (HPLC)
Hình 4.6: Sắc ký đồ mẫu thử Amlodipin khảo sát độ lặp lại (HPLC)
Bảng 4.6: Kết quả khảo sát độ lặp lại (độ chính xác) của Amlodipin
Mẫu Lƣợng cân (mg) STB KLTB viên (mg) Hàm lƣợng (%) (Xi – X)2 Xử lý kết quả Chuẩn 1 69,5 6915703,8 189,6 99,4 Qtn 1= 0,08 Chuẩn 2 69,5 Qtn 2= 0,46 Thử 1 948,6 6858607 98,7 0,25 Qlt= 0,56 Thử 2 948,8 6950504 98,8 0,16 SD = 0,488 Thử 3 948,2 6865634 98,9 0,09 RSD (%) =0,492 Thử 4 948,4 6879289 99,1 0,01 e %= ± 0,512 Thử 5 948,3 6899031 99,4 0,04 XTB = 99,2 (%) Thử 6 948,5 6865379 100 0,64 µ = 99,2 ± 0,512%
Trong đó: XTB: giá trị trung bình của 6 lần thử nghiệm. SD: độ lệch chuẩn.
RSD: độ lệch chuẩn tƣơng đối. e: giới hạn tin cậy.
Nhận xét:
Độ lệch chuẩn tƣơng đối của Amlodipin RSD = 0,492% < 2%. Vậy phƣơng pháp đạt độ lặp lại (độ chính xác).
4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát độ đúng của Amlodipin bằng phƣơng pháp HPLC phƣơng pháp HPLC
4.5.1 Mục đích
- Khảo sát độ đúng (độ phục hồi) của chuẩn Amlodipin besilat khi cho vào mẫu thử (chế phẩm) ở các mức: 80%, 100%, 120%, so với nồng độ Amlodipin besilat có sẵn trong mẫu thử (chế phẩm).
- Tính tỷ lệ phục hồi % ở từng nồng độ.
4.5.2 Thực hiện
Dung dịch chuẩn gốc:
Cân khoảng 69 mg (cân thực là 69,4 mg) Amlodipin besilat chuẩn, cho vào bình định mức 100 mL, hòa tan và thêm vừa đủ bằng pha động đƣợc dung dịch chuẩn gốc.
Dung dịch chuẩn:
Hút chính xác 5 mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 50 mL, thêm pha động vừa đủ. Lọc qua giấy lọc 0,45µm, đƣợc dung dịch chuẩn.
Dung dịch thử gốc:
Cân chính xác khoảng một lƣợng bột viên tƣơng ứng với 25 mg Amlodipin